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Overview

A citogenética é o campo de estudo dedicado aos cromossomos, e envolve a observação direta do número e estrutura cromossômica de uma célula, juntos conhecidos como seu karyótipo. Muitas anormalidades cromossômicas estão associadas à doença. Cada cromossomo em um karyótipo pode ser manchado com uma variedade de corantes para dar padrões únicos de banda. Técnicas mais recentes, incluindo hibridização genômica comparativa e fluorescência na hibridização situ (FISH), permitem detectar características ou anormalidades cromossômicas específicas.

Este vídeo começará examinando os princípios dessas técnicas de citogenética clássica e moderna. Isso é seguido por um exame de um protocolo geral para a realização do FISH. Finalmente, vários exemplos de como o karyotyping pode ser aplicado a várias aplicações médicas são apresentados.

Procedure

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Citogenética é o estudo da estrutura e propriedades dos cromossomos, bem como seu comportamento durante a divisão celular e seu papel na hereditária. Um cromossomo, que é uma molécula de DNA e suas proteínas associadas, pode ser observado sob um microscópio com o auxílio de corantes e sondas. Tais observações são uma abordagem poderosa para detectar defeitos na estrutura e número de cromossomos, que muitas vezes estão associados a doenças e distúrbios.

Este vídeo abordará os princípios da citogenética, um protocolo para uma técnica amplamente utilizada para destacar características específicas do cromossomo, conhecida como fluorescência na hibridização situ, e algumas aplicações desta técnica.

Vamos começar discutindo a importância da citogenética e os princípios por trás de algumas técnicas clássicas e modernas no campo.

A citogenética implica a observação direta da estrutura e número do cromossomo de uma célula, conhecido como seu "karyótipo". Pode ser usado para detectar desvios do diploide normal, ou número de cromossomo emparelhado, que é chamado de aneuploidia, bem como defeitos na estrutura do cromossomo.

Muitas doenças e desordens resultam de anormalidades cromossômicas. Por exemplo, o cromossomo da Filadélfia, que resulta de uma translocação recíproca entre partes dos cromossomos 9 e 22, está associado à leucemia mielógena crônica. Outro exemplo é a Trissomia 21, a causa mais comum da síndrome de Down, na qual uma cópia extra do cromossomo 21 é herdada.

Karyotyping é geralmente realizado em células que estão se preparando para dividir, quando seus cromossomos são condensados e podem ser facilmente distinguidos.

Cromossomos em um karyótipo podem ser tratados com manchas que revelam padrões distintos de banda. Cromossomos manchados podem então ser organizados por tamanho e forma para análise de karyótipo. Vários corantes podem ser aplicados para destacar características cromossômicas específicas. Manchar com Giemsa, ou banda G, marca densamente embalado, geralmente regiões pobres em genes ricas em bases A-T. A banda R é uma mancha reversa de Giemsa que destaca regiões cromossômicas ricas em bases G-C. A banda C destaca as regiões cromossômicas mais densas ao redor do centromer, a estrutura que une as metades idênticas de um cromossomo duplicado, enquanto a banda T destaca as extremidades dos cromossomos, ou telômeros.

Outra técnica, chamada fluorescência na hibridização situ, ou FISH, permite a detecção de cromossomos específicos, regiões de DNA ou transcrições de RNA. Isso é conseguido incubando uma amostra com sondas oligonucleotidas altamente específicas que são rotuladas fluorescentemente. Como essas sondas podem ser hibridizadas para cromossomos não condensados em células não-divisórias, os PEIXEs podem ser mais amplamente aplicados do que os métodos clássicos de karyotipagem.

Finalmente, os pesquisadores também desenvolveram um método chamado hibridização genômica comparativa para triagem de regiões cromossômicas ausentes ou duplicadas. O DNA genômico de um sujeito de teste e controle são isolados, fragmentados e rotulados com diferentes fluoroforos coloridos. As preparações genômicas fragmentadas são então misturadas e competitivamente hibridizadas a uma propagação normal do cromossomo. As cores do karyótipo resultante indicam se uma região é duplicada na amostra de ensaio, o que gera mais fragmentos para ligar a propagação, ou se a região é excluída, resultando em vinculação preferencial aos fragmentos de controle mais abundantes.

Agora que você entende os princípios da citogenética, vamos colocá-los em prática e dar uma olhada mais de perto em como o FISH é realizado.

Primeiro, tecidos isolados ou células são tratados com um fixador como o paraformaldeído para preservar a morfologia e integridade do cromossomo. Em seguida, um spread cromossomo é preparado, por exemplo, interrompendo mecanicamente o material. Os cromossomos são então desidratados em uma série de soluções de aumento das concentrações de etanol, e permeabilizados em uma solução pepsina para tornar as seqüências-alvo mais acessíveis às sondas. Os cromossomos são então lavados e estabilizados com um pós-fixado, desnaturados com formamida para que o DNA agora monofaçado possa ligar as sondas, e desidratado em uma segunda série de soluções de etanol cada vez mais concentradas.

Sondas de DNA fluorescentes e altamente específicas são preparadas e misturadas com fragmentos de DNA repetitivos não rotulados para bloquear a ligação não específica. A sonda é então aplicada ao spread cromossomo, onde hibridiza para sua sequência de destino, e a sonda desvinculada é removida com uma série de lavagens.

Finalmente, os cromossomos são montados em um meio que preserva a amostra e contém uma contra-mancha de DNA geral, como o DAPI que rotula o DNA genômico de fundo, e uma mancha de cobertura é aplicada. Neste ponto, as amostras podem ser observadas sob um microscópio de fluorescência usando os conjuntos de filtros apropriados para visualizar o DNA genômico e características específicas da sequência.

Depois de ver como o FISH é realizado, vamos olhar para algumas aplicações desta técnica poderosa.

Os peixes podem ser usados para confirmar que o karyótipo de um embrião é normal antes da implantação. Aqui, uma única célula, conhecida como blastomere, foi biópsia de um embrião três dias após a fertilização, depois liseada e fixada diretamente em um slide de microscópio. A propagação do cromossomo foi então hibridizada para sondas especificamente selecionadas para identificar possíveis distúrbios cromossômicos. Neste caso, desvios do padrão esperado de sinais de hibridização indicam interrupções no número ou estrutura do cromossomo.

Técnicas inovadoras também foram desenvolvidas para rotular todos os cromossomos a partir de uma única amostra biológica. Um desses métodos envolve o dispositivo Octochrome, um slide de vidro de oito células pré-carregado com sondas fluorescentes. Todos os 22 cromossomos determinantes não-sexuais, chamados de autossitamentos, e os dois cromossomos sexuais foram rotulados distribuindo-os entre as oito janelas, cada um contendo três fluoroforos específicos do cromossomo. Isso permitiu a triagem simultânea de todos os cromossomos a partir de uma única hibridização.

Finalmente, em vez de separar as sondas em diferentes janelas em um slide, todos os cromossomos podem ser rotulados e, em seguida, detectados juntos usando uma abordagem chamada karyotipping espectral ou SKY. Várias sondas específicas do cromossomo com diferentes rótulos fluorescentes foram hibridizadas para cada cromossomo, dando a cada um uma cor espectral única. Observações simultâneas da mistura de cromossomos combinados são particularmente úteis para identificar defeitos do karyótipo, e podem ser usadas para identificar aneuploidia, bem como exclusões cromossômicas e translocações.

Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre citogenética. Neste vídeo, você aprendeu sobre os princípios da citogenética, técnicas como karyotyping e FISH que são usadas para destacar características específicas do cromossomo, e aplicações dessas técnicas. Os recentes avanços na citogenética aumentaram suas capacidades em laboratórios de pesquisa e patologia, e continuarão a encontrar uso generalizado na vanguarda da pesquisa e diagnóstico de doenças. Obrigado por assistir!

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