Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

Una panoramica dell'espressione genica
 
Click here for the English version

Una panoramica dell'espressione genica

Overview

L'espressione genica è il processo complesso in cui una cellula utilizza le sue informazioni genetiche per produrre prodotti funzionali. Questo processo è regolato in più fasi e qualsiasi cattiva regolamentazione potrebbe portare a malattie come il cancro.

Questo video evidenzia importanti scoperte storiche relative all'espressione genica, compresa la comprensione di come combinazioni distinte di basi di DNA codificano gli amminoacidi che compongono le proteine. Vengono esplorate le questioni chiave nel campo della ricerca sull'espressione genica, seguite da una discussione su diverse tecniche utilizzate per misurare l'espressione genica e studiarne la regolazione. Infine, esaminiamo come gli scienziati stanno attualmente utilizzando queste tecniche per studiare l'espressione genica.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

L'espressione genica è il processo in cui le informazioni contenute nel DNA di una cellula vengono utilizzate per produrre prodotti funzionali. Questa procedura attentamente orchestrata è regolata in più fasi e la cattiva regolamentazione può spesso causare malattie come il cancro.

Questo video fornisce una panoramica della storia della ricerca sull'espressione genica, delle domande chiave, dei metodi sul campo e di come queste tecniche vengono applicate.

Inizieremo esaminando alcune importanti scoperte sull'espressione genica.

Il primo modello convincente su come il DNA potrebbe trasportare informazioni genetiche fu stabilito nel 1953, quando Francis Crick e James Watson, con l'aiuto dei dati di Rosalind Franklin, risolsero la struttura del DNA, una doppia elica composta da due catene lineari di basi nucleotidiche disposte in una sequenza definita, ma infinitamente variabile.

Cinque anni dopo, Crick propose due idee importanti che avrebbero costituito la spina dorsale della nostra comprensione dell'espressione genica. La sua "ipotesi di sequenza" ha suggerito che la sequenza nucleotidica del DNA viene utilizzata, tramite un intermedio di RNA instabile, come codice per le sequenze di amminoacidi delle proteine. Allo stesso tempo, il suo "dogma centrale" ipotizzava i diversi flussi di informazioni genetiche che possono verificarsi e, in particolare, sosteneva che le informazioni non possono essere trasferite dalle proteine agli acidi nucleici.

Nel 1960, François Jacob e Jacques Monod, attraverso il loro lavoro sui geni che metabolizzano il lattosio nei batteri, proposero un modello per la regolazione dell'espressione genica. Hanno suggerito che l'espressione di "geni strutturali", che svolgono funzioni strutturali o enzimatiche, è controllata dai prodotti di "geni regolatori" che si legano a siti regolatori adiacenti. Ora sappiamo che modalità sostanzialmente simili di regolazione genica, mediate da proteine chiamate fattori di trascrizione, si verificano in tutti gli organismi.

Un anno dopo, nel 1961, Jacob, insieme a Sydney Brenner, scoprì il messaggero o "m"-RNA come l'intermedio instabile tra DNA e proteine proposto da Crick. Nello stesso anno, Brenner e Crick iniziarono a decifrare il "codice genetico", che detta come le informazioni nel DNA codificano le proteine. Hanno determinato che ogni tripletta di nucleotidi adiacenti, o un "codone", specifica uno dei 20 amminoacidi che costituiscono le proteine.

Negli anni successivi, i ricercatori guidati da Marshall Nirenberg, Har Gobind Khorana e Severo Ochoa hanno utilizzato più approcci per definire gli amminoacidi codificati da tutti i 64 possibili codoni. Con il cracking del codice genetico, gli scienziati hanno continuato a studiare come viene regolata l'espressione genica.

Una scoperta importante arrivò nel 1974, quando Roger Kornberg e colleghi dimostrarono che il DNA nelle cellule eucariotiche, come quelle di animali e piante, è "avvolto" attorno a complessi di proteine istoniche, producendo strutture ora chiamate "nucleosomi". Ora sappiamo che i cambiamenti nella struttura della cromatina svolgono un ruolo importante nella regolazione genica.

Un'altra svolta avvenne nel 1977, quando Phil Sharp e Rich Roberts scoprirono che le sequenze di mRNA non erano del tutto complementari ai loro corrispondenti modelli di DNA. Alcune "regioni mancanti", ora chiamate introni, vengono rimosse tra gli esoni codificanti proteine nel trascritto dell'RNA maturo in un processo noto come "splicing". Cinque anni dopo, il gruppo di ricerca di Ronald Evans ha dimostrato che lo splicing "alternativo" dello stesso trascritto potrebbe produrre varianti, o "isoforme", della stessa proteina con funzioni diverse.

Dal 1990, la nostra comprensione della complessità delle reti di regolazione genica si è espansa notevolmente con la scoperta del silenziamento genico mediato dall'RNA. Ora sappiamo che diverse famiglie di piccoli RNA, con membri di dimensioni 20-30, regolano l'espressione genica in vari modi.

Dopo aver esaminato la storia della ricerca sull'espressione genica, diamo un'occhiata ad alcune delle principali domande sul campo.

Un argomento studiato è come i fattori di trascrizione regolano i geni. Gli scienziati non sono solo interessati a identificare le sequenze genomiche legate da fattori di trascrizione, ma stanno anche esaminando come le proteine regolatorie interagiscono tra loro per integrare i segnali e regolare l'espressione genica.

Altri ricercatori studiano lo splicing alternativo e come questo processo è regolato in diversi contesti biologici. Inoltre, alcuni di loro stanno cercando di determinare se le isoforme proteiche hanno sempre funzioni diverse e distinte.

Infine, molti ricercatori stanno studiando il meccanismo d'azione dei piccoli RNA e stanno cercando di identificare i loro obiettivi normativi. C'è anche un crescente interesse nel fatto che i piccoli RNA possano essere utilizzati come "biomarcatori" per diagnosticare le malattie.

Ora, diamo un'occhiata agli strumenti che i ricercatori usano per valutare l'espressione genica.

Un metodo popolare è la trascrizione inversa, o "RT"-PCR, che converte l'RNA in DNA complementare o "c" prima di sottoporlo ad amplificazione. Includendo molecole fluorescenti che sono incorporate nel DNA durante la PCR, è possibile utilizzare questa tecnica per misurare quantitativamente l'espressione genica e osservare i risultati in "tempo reale".

Per valutare contemporaneamente l'espressione di migliaia di geni, è possibile utilizzare microarray. Qui, le sequenze di DNA vengono "stampate" su vetrini, che vengono poi ibridati a sonde fluorescenti generate dall'RNA campione. Il modello di fluorescenza risultante può essere utilizzato per identificare i geni espressi.

Un'altra tecnica per profilare l'espressione genica è quella di sequenziare il trascrittoma o tutti gli RNA espressi in una cellula. Qui, il cDNA generato da campioni di RNA è sottoposto a sequenziamento ad alto rendimento. A differenza dei microarray, il sequenziamento del trascrittoma non richiede informazioni genomiche preesistenti e può essere utilizzato per identificare trascritti sconosciuti o nuove isoforme geniche.

I ricercatori possono anche valutare visivamente dove un gene viene espresso utilizzando l'ibridazione in situ. In questa tecnica, l'RNA viene prima ibridato con sonde complementari, che possono quindi essere riconosciute da anticorpi coniugati con enzimi che producono un colore visivo o un segnale di fluorescenza.

Il test del reporter è un'altra tecnica che può fornire informazioni sulla regolazione genica. Il prodotto del gene reporter genera un segnale come il colore o la fluorescenza. Il reporter può essere fuso direttamente con un gene di interesse, o essere posto sotto il controllo di una sequenza regolatrice, come il promotore che guida la trascrizione di un gene, o un elemento potenziatore più distante. Il segnale del reporter può quindi fungere da lettura per l'attività dell'elemento regolatore o il modello di espressione del gene di interesse.

Infine, l'immunoprecipitazione della cromatina o "ChIP" può essere utilizzata per identificare i siti genomici a cui i fattori di trascrizione si legano quando regolano l'espressione genica. Qui, i complessi di proteine e il DNA che legano sono isolati da anticorpi e il DNA bersaglio viene identificato mediante PCR o sequenziamento.

Dopo aver esaminato i metodi per studiare l'espressione genica, diamo un'occhiata ad alcune delle loro applicazioni.

Le cellule all'interno di una popolazione possono presentare sottili differenze nell'espressione genica che possono avere conseguenze biologiche. In questo studio, i ricercatori hanno collocato singole cellule staminali embrionali umane della stessa coltura in pozzetti separati su una piastra. Utilizzando la RT-PCR quantitativa, gli scienziati hanno determinato che l'espressione di Nanog –un "marcatore" di cellule staminali – differiva all'interno di un campione.

Alcuni ricercatori studiano se diverse isoforme di proteine regolatorie funzionano in modo diverso. Qui, ChIP è stato applicato alle cellule immunitarie umane per identificare gli obiettivi di legame delle isoforme "lunghe" e "corte" di una proteina. I risultati del sequenziamento hanno mostrato che alcuni bersagli genici sono stati riconosciuti solo dall'isoforma breve, indicando potenziali differenze funzionali.

Infine, i saggi reporter possono essere utilizzati per valutare la regolazione genica mediata da piccoli RNA, come i microRNA. Poiché i microRNA possono inibire l'espressione genica legandosi alle regioni non tradotte 3¢ degli mRNA, gli scienziati hanno collegato questa regione da geni diversi a un reporter della luciferasi e hanno introdotto ciascuno di essi nelle cellule insieme a un microRNA. I bersagli genici del microRNA sono stati quindi identificati cercando cellule con segnale di luminescenza ridotto.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'espressione genica. Abbiamo esaminato i principali risultati nella ricerca sull'espressione genica, domande e metodi importanti nel campo e alcune applicazioni attuali. Come sempre, grazie per aver guardato!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter