Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 

Overview

בין שיטות שונות להערכת ביטוי גנים, רצף תפוקה גבוהה של RNA, או RNA-seq. הוא אטרקטיבי במיוחד, כפי שניתן לבצע ולנתח מבלי להסתמך על מידע גנומי זמין מראש. במהלך RNA-seq, RNA מבודד מדגימות עניין משמש ליצירת ספריית DNA, אשר לאחר מכן מוגברת ורצף. בסופו של דבר, RNA-seq יכול לקבוע אילו גנים באים לידי ביטוי, את רמות הביטוי שלהם ואת נוכחותם של כל תמלילים שלא היו ידועים קודם לכן.

כאן, JoVE מציג את העקרונות הבסיסיים מאחורי RNA-seq. לאחר מכן אנו דנים בצעדים הניסיוניים והאנליטיים של פרוטוקול RNA-seq כללי. לבסוף, אנו בוחנים כיצד חוקרים משתמשים כיום ב-RNA-seq, למשל, כדי להשוות ביטוי גנים בין דגימות ביולוגיות שונות, או כדי לאפיין אינטראקציות בין חלבון לרנ"א.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ריצוף RNA, או RNA-seq, היא טכניקה שיכולה לספק מידע על הרצף והכמות של כל RNA המבוטא, המכונה "שעתוק", באוכלוסיית תאים. שלא כמו שיטות אחרות ליצירת פרופיל ביטוי כגון microarrays, הכוללות בדיקות עבור רצפי RNA ידועים, RNA-seq יכול פרופיל ביטוי גנים של אורגניזמים עם גנומים לא רצפים. בנוסף, RNA-seq יכול למדוד במדויק טווח גדול יותר של רמות ביטוי תעתיק מאשר microarrays, במיוחד ברמות נמוכות מאוד או גבוהות מאוד.

וידאו זה יכסה את העקרונות של RNA-seq, פרוטוקול להכנת ספריית RNA-seq וניתוח הנתונים, וכמה יישומים של טכניקה זו.

ראשית, בואו נסקור כמה עקרונות מאחורי RNA-seq. רצף תמלול דורש בידוד אוכלוסייה של תמלילים שרמותיהם יש למדוד. רוב הרנ"א בתאים הוא RNA ריבוזומלי, או rRNA, המרכיב המרכזי של מכונות ייצור החלבון של התא. כדי להקל על התאוששות של סוגים אחרים של תמלילים, rRNA מוסר בדרך כלל לפני הרצף על ידי הכלאת המדגם לאוליגונוקלאוטידים משלימים המחוברים לחרוזים מגנטיים, ושימוש במגנט כדי להפריד את ה- rRNA משאר המדגם.

לחלופין, ניתן לבחור אוכלוסייה ספציפית של RNA לרצף. לדוגמה, ניתן ללכוד RNAs שליח קידוד חלבונים, או mRNAs עם "אוליגו-dT" - קטעים קצרים של נוקלאוטידים deoxy-T שנקשרים לרצף של בסיסים A המכונה זנב פולי-A בסוף תמלילים אלה. rRNA מזהם מוסר לאחר מכן. MicroRNAs, שהם RNAs רגולטוריים 22 נוקלאוטיד, ניתן לבודד באופן סלקטיבי עבור רצף בהתבסס על גודלם. מכיוון שרנ"א נוטה מטבעו להשפלה, הוא הפוך תחילה לדנ"א דו-גדילי.

רצפי אוליגונוקלאוטידים המכונים מתאמים נקשרים לאחר מכן לרסיסי הדנ"א. המתאמים מכילים אזורים קבועים המשמשים כאתרים מחייבי פריימר להגברת PCR עוקבת, ואלה הם בדרך כלל אסימטריים כך ש"התקועות " של התבנית נשמרת. המתאמים מכילים גם רצפים ייחודיים, המכונים "ברקודים", המזהים את כל הקטעים שמקורם במדגם יחיד. לאחר מכן, הספריה מוגברת על-ידי PCR.

שבב רצף, שעליו יש אוליגונוקלאוטידים משלימים את המתאמים, משמש לשתק את דגימת הספרייה, המדוללת כך שמולקולות הדנ"א מחזות על השבב בצפיפות נמוכה. הדנ"א מוגבר על השבב באמצעות תהליך שנקרא "הגברת גשר" ליצירת "אשכולות כלות". שברים קצרים, כל אורך של 30-150 בסיסים, מסונתזים לאחר מכן מקצה אחד או שניים של תבניות DNA אלה, ויוצרים מאות מיליוני מוצרים המכונים קריאות רצף.

לאחר מכן מנתחים את תוצאות הרצף עבור איכות והנתונים מעובדים. ניתוח הרצפים יכול לחשוף מגוון רחב של מידע, כולל הבדלים ברמות הביטוי של RNAs בין דגימות ותמלילים או צורות של תמלילים שלא היו ידועים קודם לכן.

עכשיו שראינו איך RNA-seq עובד, בואו נעבור פרוטוקול להכנת ספריית RNA-seq וניתוח נתוני הרצף. RNA מתקבל לראשונה מדגם העניין, ואיכותו נבדקת על ידי אלקטרופורזה, למשל באמצעות מכשיר microfluidics הנקרא ביואנלייזר. ה- RNA חייב להיות באיכות גבוהה לקבלת תוצאות רצף מדויקות. כדי להבטיח את היעדר זיהום ה- DNA, RT-PCR עבור גן מבוטא מתנהל עם או בלי תמלול הפוך. לא אמורים להיות מוצרים בהיעדר תמלול הפוך.

כדי לבחור RNA פולי-A, הדגימות מאוגדות לבדיקות אוליגו-dT המחוברות לחרוזים מגנטיים. הרנ"א שנבחר מקוטע לחתיכות 200-נוקלאוטיד בטמפרטורה גבוהה בנוכחות יוני מגנזיום, מה שמפחית הטיות תלויות אורך בתגובות ובניתוחים הבאים. לאחר מכן, השברים מומרים לדנ"א דו-גדילי, והמתאמים נקשרים. הספרייה מוגברת על ידי PCR, ואיכותה נבדקת על ביואנלייזר ועל ידי ביצוע qPCR. תוצאות הביואנליצר אמורות לחשוף שיא של מוצרים בגודל הצפוי בהתבסס על גודל השבר הממוצע ואורך המתאמים.

ניתן לערבב ספריות מדגימות שונות, המכילות מתאמי ברקוד שונים, יחד עם דגימה של DNA התייחסות שנוספה בריכוז נמוך כבוקרת איכות לשלבים הבאים של התהליך, כגון יצירת אשכול כליות ותגובות הרצף. התערובת מתווספת לשבב רצף ונטענת למכונה.

במהלך תגובת הרצף מנוטרת הצפיפות של אשכולות דנ"א: היא לא חייבת להיות גבוהה מדי, מה שעלול להוביל לזיהום צולב, או נמוך מדי, מה שעלול להוביל לנתונים לא מספיקים. איכות הרצף ניתנת על-ידי ציון Q, המציין את הסבירות לזיהוי בסיס שגוי. ציוני Q עבור רוב הבסיסים צריכים להיות גדולים מ- 30, מה שמתאים לסיכוי של פחות מ- 1 ב- 1000 לקריאה שגויה. שחזור רצפי ה- DNA של ההפניה בקצב הצפוי מציין שכל רצפי הספריה מיוצגים באופן שווה.

קריאות הנוצרות על-ידי רצף חופפות זו לזו כדי להסיק את ה- RNA שרצף. עבור אורגניזמים עם מידע גנום זמין, קריאות ניתן ליישר לגנום הייחוס. מספר הקריאות לכל תעתיק נספר כדי למדוד את השפע של כל RNA.

לאחר שראינו כיצד פועל RNA-seq, בואו נסתכל על כמה דרכים שבהן נעשה בו שימוש.

רצף Transcriptome יכול לזהות גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בתנאים שונים. לדוגמה, בניסוי זה הושוו תמלולים של זחלי יתושים המיוצרים בתנאי גדילה שונים. למרות שלמין מסוים זה של יתוש נושא מחלות אין גנום רצף, החוקרים הצליחו להשוות את מידע התמלול שהושג למינים רצפים אחרים, ולזהות גנים עם רמות ביטוי מוגברות או מופחתות.

RNA-seq יכול לשמש גם "בדיקות עיתונאיות מקבילות באופן מאסיבי" כדי לחקור מנגנוני רגולציה של גנים. זה נעשה על ידי טרנספקט של תאי יונקים עם ספרייה של אלפי פלסמידים, שכל אחד מהם מכיל גרסה מוטציה של אתר רגולטורי גנטי "מניע" את התמלול של רצף עיתונאי המצמיד לתגיות ייחודיות. לאחר בידוד RNA ורצף תפוקה גבוהה, הרמות של כל תג מוערכות כדי להעריך ביטוי עיתונאי מכל מבנה, אשר נותן תובנה על החשיבות התפקודית של הנוקלאוטידים מוטציה בכל גרסה אתר רגולטורי.

לבסוף, ניתן להתאים את ריצוף הרנ"א לחקר אינטראקציות בין חלבון RNA, במיוחד כדי לזהות תמלילים שחלבון בעל עניין נקשר אליו. החלבון הוא immunoprecipitated עם נוגדנים ואת RNAs מאוגדים מוגדרים על ידי רצף. אם מתחמי חלבון הרנ"א מוצלבים בהתחלה, ניתוח רצף יכול למפות את האתר של הקישור הצולב ולזהות את אתר כריכת החלבון ברנ"א עד לרמת הנוקלאוטיד.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב ברנ"א-סק. בסרטון וידאו זה, ראינו כיצד דגימות RNA מומרים לספריות, רצפים והנתונים המתקבלים מנותחים, כמו גם את סוגי המידע שניתוח רצף יכול לספק. הודות לרגישותו, פוטנציאל השימוש בכל אורגניזם, ועלות הרצף המופחתת, RNA-seq משמש יותר ויותר בתחומים מרובים של מחקר גנטיקה, ויספק תובנה לשאלות רבות סביב תפקוד התא והתפתחותו. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter