Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 

Overview

유전자 발현을 평가하는 다른 방법 중, RNA의 높은 처리량 시퀀싱, 또는 RNA-seq. 특히 매력적이며, 이전에 이용 가능한 게놈 정보에 의존하지 않고 수행하고 분석할 수 있기 때문에 특히 매력적입니다. RNA-seq 동안, 관심있는 샘플에서 분리 된 RNA는 DNA 라이브러리를 생성하는 데 사용되며, 이는 증폭되고 시퀀스됩니다. 궁극적으로 RNA-seq는 어떤 유전자가 표현되는지, 발현 수준 및 이전에 알려지지 않은 성적증명서의 존재를 결정할 수 있습니다.

여기서 JoVE는 RNA-seq의 기본 원리를 제시합니다. 그런 다음 일반적인 RNA-seq 프로토콜의 실험 및 분석 단계에 대해 논의합니다. 마지막으로, 우리는 연구원이 현재 RNA-seq를 어떻게 사용하고 있는지, 예를 들면, 다른 생물학 견본 사이 유전자 발현을 비교하거나, 단백질-RNA 상호 작용을 특성화하기 위하여 검토합니다.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

RNA 시퀀싱, 또는 RNA-seq는 세포 집단에서 "전사"로 알려진 발현된 모든 RNA의 서열 및 양에 대한 정보를 제공할 수 있는 기술이다. 알려진 RNA 서열에 대한 프로빙을 포함하는 마이크로어레이와 같은 다른 발현 프로파일링 방법과 달리 RNA-seq는 불순한 게놈을 가진 유기체로부터유전자 발현을 프로파일링할 수 있다. 추가적으로, RNA-seq는 마이크로어레이보다는 성적증명서 발현 수준의 더 큰 범위를 정확하게 측정할 수 있습니다, 특히 아주 낮거나 아주 높은 수준에서.

이 비디오는 RNA-seq의 원리, RNA-seq 라이브러리를 준비하고 데이터를 분석하기위한 프로토콜, 그리고이 기술의 일부 응용 프로그램을 다룰 것입니다.

먼저 RNA-seq의 몇 가지 원리를 살펴보겠습니다. 전사 순서는 그 수준을 측정할 수 있는 성적증명서의 인구를 격리할 것을 요구합니다. 세포내 대부분의 RNA는 세포의 단백질 생산 기계의 중앙 성분인 리보소말 RNA 또는 rRNA이다. 다른 유형의 전사체의 회복을 용이하게 하기 위해 rRNA는 일반적으로 시료를 교화하여 자기 비드에 부착된 보완적인 올리고뉴클레오티드에 혼성화하고, 자석을 사용하여 rRNA를 샘플의 나머지 부분에서 분리함으로써 제거된다.

대안적으로, RNA의 특정 인구는 시퀀싱을 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 단백질 코딩 메신저 RNA 또는 mRNA는 이러한 성적증명서의 끝에 폴리-A 꼬리로 알려진 A염기의 서열에 결합하는 데옥시-T 뉴클레오티드의 짧은 스트레칭인 "올리고-dT"로 포획될 수 있다. 오염 rRNA는 그 때 제거됩니다. 22-뉴클레오티드 규제 RNA인 MicroRNA는 크기에 따라 시퀀싱을 위해 선택적으로 격리될 수 있다. RNA는 본질적으로 저하되기 쉽기 때문에 이중 좌초 된 DNA로 전사된 첫 번째 역입니다.

어댑터로 알려진 올리고뉴클레오티드 서열은 DNA 단편에 계각된다. 어댑터는 후속 PCR 증폭을 위한 프라이머 바인딩 사이트역할을 하는 일정한 영역을 포함하며, 템플릿의 "좌초"가 보존되도록 일반적으로 비대칭입니다. 어댑터에는 단일 샘플에서 발생하는 모든 조각을 식별하는 "바코드"라고 하는 고유한 시퀀스가 포함되어 있습니다. 그런 다음 라이브러리가 PCR에 의해 증폭됩니다.

어댑터에 보완적인 올리고뉴클레오티드가 있는 시퀀싱 칩은 DNA 분자가 저밀도로 칩에 음침을 음침하도록 희석되는 라이브러리 샘플을 고정하는 데 사용됩니다. DNA는 "클로날 클러스터"를 형성하기 위해 "다리 증폭"이라는 과정을 통해 칩에 증폭됩니다. 짧은 조각, 길이각 30-150 기지, 다음 시퀀싱 읽기로 알려진 제품의 수억을 생성, 이러한 DNA 템플릿의 한쪽 또는 양쪽 끝에서 합성된다.

그런 다음 시퀀싱 결과를 품질에 대해 분석하고 데이터가 처리됩니다. 시퀀스를 분석하면 샘플과 이전에 알려지지 않은 성적증명서 또는 성적증명서 형태 간의 RNA 발현 수준 차이를 포함하여 다양한 정보를 나타낼 수 있습니다.

이제 RNA-seq가 어떻게 작동하는지 보았으니 RNA-seq 라이브러리를 준비하고 서열 데이터를 분석하기 위한 프로토콜을 살펴보겠습니다. RNA는 먼저 관심있는 샘플에서 수득되며, 그 품질은 예를 들어 생체 분석기라고 하는 미세 유체 장치를 사용하여 전기전경에 의해 검사된다. RNA는 정확한 염기서열 분석 결과를 위해 고품질이어야 합니다. DNA 오염의 부재를 보장하기 위해 발현 유전자에 대한 RT-PCR은 역전사 유무에 관계없이 수행됩니다. 역 전사가 없는 경우 제품이 없어야 합니다.

폴리-A RNA를 선택하기 위해, 샘플은 자기 구슬에 부착된 올리고 dT 프로브에 결합된다. 선택된 RNA는 마그네슘 이온이 존재하여 고온에서 200-뉴클레오티드 조각으로 단편화되어 후속 반응 및 분석에서 길이 의존적 편향을 감소시킵니다. 파편은 그 때 이중 좌초된 DNA로 변환되고, 어댑터는 계각됩니다. 라이브러리는 PCR에 의해 증폭되고, 그 품질은 바이오 분석기및 qPCR을 수행하여 확인됩니다. 바이오 분석기 결과는 어댑터의 평균 조각 크기와 길이에 따라 예상되는 크기의 제품 피크를 밝혀야 합니다.

상이한 바코드 어댑터를 포함하는 상이한 샘플의 라이브러리는 클로날 클러스터 생성 및 시퀀싱 반응과 같은 프로세스의 후속 단계에 대한 품질 관리로서 낮은 농도로 첨가된 기준 DNA 샘플과 함께 혼합될 수 있다. 혼합물은 시퀀싱 칩에 첨가되어 기계에 로드됩니다.

시퀀싱 반응 중에 DNA 클러스터의 밀도가 모니터링됩니다: 너무 높지 않아야 하며, 이는 교차 오염으로 이어질 수 있거나 너무 낮아서 데이터가 부족할 수 있습니다. 시퀀싱의 품질은 Q 점수에 의해 주어지며, 이는 잘못된 베이스가 식별될 가능성을 나타냅니다. 대부분의 베이스의 Q 점수는 30을 초과해야 하며, 이는 잘못된 읽기의 경우 1000분의 1 미만의 확률에 해당합니다. 예상 속도로 참조 DNA 서열의 회복은 모든 라이브러리 서열이 고르게 표현된다는 것을 나타냅니다.

시퀀싱에 의해 생성된 판독값은 서로 겹쳐서 시퀀싱된 RNA를 추론합니다. 유전체 정보를 사용할 수 있는 유기체의 경우, 판독은 기준 게놈에 정렬될 수 있다. 성적 증명서 당 읽기의 수는 각 RNA의 풍부를 측정하기 위해 계산됩니다.

RNA-seq가 어떻게 작동하는지 확인한 후, 몇 가지 방법으로 사용되고 있는지 살펴보겠습니다.

전사 순서는 다른 조건 하에서 분화되는 유전자를 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 본 실험에서, 상이한 성장 조건하에서 생성된 모기 유충의 전사를 비교하였다. 이 특정 종의 질병 운반 모기는 서열게놈이 없더라도, 연구원은 다른 순서한 종에 얻은 전사 정보를 비교하고, 증가되거나 감소된 발현 수준으로 유전자를 확인할 수 있었습니다.

RNA-seq는 또한 유전자 조절 메커니즘을 연구하기 위하여 "대규모 병렬 리포터 assays"에서 이용될 수 있습니다. 이것은 수천 개의 플라스미드 라이브러리와 포유류 세포를 횡단하여 수행되며, 각각 유전자 조절 부위의 돌연변이 변이체를 포함하는 "운전"독특한 태그에 결합된 기자 서열의 전사를 포함합니다. RNA 격리 및 고처리량 시퀀싱에 이어, 각 태그의 수준은 각 구성에서 기자 발현을 평가하기 위해 평가되며, 이는 각 조절 부위 이체에서 돌연변이된 뉴클레오티드의 기능적 중요성에 대한 통찰력을 제공한다.

마지막으로, RNA 시퀀싱은 특히 관심의 단백질이 결합하는 성적증명서를 식별하기 위해 RNA 단백질 상호 작용을 연구하도록 조정할 수 있습니다. 단백질은 항체로 면역 침전되고 바운드 된 RNA는 시퀀싱에 의해 정의됩니다. RNA-단백질 복합체가 처음에 교차 연결되는 경우, 시퀀싱 분석은 크로스링크의 부위를 매핑하고 RNA에 단백질 결합 부위를 뉴클레오티드 수준까지 식별할 수 있다.

당신은 RNA-seq에 조브의 비디오를 보았다. 이 비디오에서는 RNA 샘플이 라이브러리, 시퀀싱 및 결과 데이터 분석, 시퀀싱 분석 으로 변환되는 방법과 시퀀싱 분석이 제공할 수 있는 정보의 유형을 보았습니다. 민감도, 어떤 유기체에서 사용될 가능성, 그리고 시퀀싱 비용이 낮아짐에 따라 RNA-seq는 여러 가지 유전학 연구에서 점점 더 많이 사용되고 있으며 세포 기능 및 개발을 둘러싼 많은 질문에 대한 통찰력을 제공합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter