Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

ניתוח מתילציה של DNA
 
Click here for the English version

ניתוח מתילציה של DNA

Overview

מתילציה ב CpG dinucleotides הוא שינוי כימי של DNA המשוער לשחק תפקידים חשובים בוויסות ביטוי גנים. בפרט, מתילציה של אשכולות של אתרי מתילציה, הנקראים "איי CpG", ליד מקדמים ואלמנטים רגולטוריים גנים אחרים עשויה לתרום להשתקה יציבה של גנים, למשל, במהלך תהליכים אפיגנטיים כגון הטבעה גנומית וחוסר פעילות X-כרומוזום. יחד עם זאת, מתילציה CpG חריג הוכח להיות קשור לסרטן.

בסרטון זה יוצגו הפונקציות הביולוגיות והמנגנונים של מתילציה של DNA, יחד עם טכניקות שונות המשמשות לזיהוי אתרי מתילציה בגנום. לאחר מכן נבחן את השלבים של ניתוח ביסולפיט, אחת השיטות הנפוצות ביותר לאיתור מתילציה DNA, כמו גם כמה יישומים של טכניקה זו.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מתילציה של דנ"א היא שינוי כימי של דנ"א המשפיע על ביטוי גנים בהקשרים תאיים שונים. חוקרים רבים מתעניינים במנגנון ובתפקודים של תהליך זה, שכן מתילציה דנ"א חריגה נקשרה למחלות כגון סרטן.

בסרטון זה, נסקר את העקרונות שמאחורי מתילציה DNA ושיטות כדי לזהות אותו. לאחר מכן, נחקור פרוטוקול כללי לאחת השיטות האלה, ניתוח ביסולפיט, וכמה יישומים של טכניקה זו.

ראשית, בואו נסתכל על מה זה מתילציה DNA וכיצד ניתן לזהות אותו.

במהלך תהליך ביוכימי זה, תא מוסיף תג כימי המכונה קבוצת מתיל לבסיסי ציטוסין בדנ"א שלו. רוב הציטוצינים המתילים מתרחשים ליד בסיסי גואנין באותו גדיל דנ"א, והנוקלאוטידים הסמוכים הללו – וקשר הזרחן המקשר ביניהם – מכונים "CPGs". למרות שרוב CPGs בעלי חוליות הם מתילציה, אלה שאינם מתויגים נוטים להתרחש קרוב זה לזה ב- CpG "איים" ליד מקדמי הגנים המבוטאים באופן פעיל, ואלמנטים שונים אחרים של רצף רגולטורי.

כיצד שינויים במתילציה DNA לתרום ויסות גנים הוא עדיין נושא לחקירה אינטנסיבית. נראה כי מתילציה של איי CpG חשובה להשתקת הגנים היציבה וארוכת הטווח הנראית בתהליכים אפיגנטיים כגון הטבעה גנומית, שהיא הביטוי הספציפי של הורה המוצא של גנים מסוימים, כמו גם אי-פעילות כרומוזום X, ההשתקה של אחד משני כרומוזומי X בכל תא של יונקים נקביים. דיכוי של גנים קריטיים עקב מתילציה חריגה של איי CpG הוכח גם לתרום צמיחת תאים בלתי מבוקרת, אשר יכול להוביל לסרטן. מבחינה מכנית, מתילציה של דנ"א עשויה לתרום להשתקת גנים על ידי מניעת גורמי שעתוק מלהתרועע עם מקדמים, או על ידי גיוס חלבונים שמשנים את היסטונים ומשפצים כרומטין למצב לא מתירני.

ישנן מספר שיטות לזיהוי מצב המתילציה של ה- DNA.

טכניקה אחת, HELP assay, כוללת שני אנדונקולאזים מגבילים הנקראים HpaII ו- MspI, אשר בהתאמה דבק רק ללא מורתיל, או שניהם מתיל ולא מתויג, רצפי CCGG. על ידי השוואת דפוסי העיכול המיוצרים על ידי שני אנזימים אלה, ניתן להסיק את מצב המתילציה של ה- DNA.

שיטה אחרת, הנקראת אימונופרציפיטציה של DNA מתילציה או "MeDIP", משתמשת בנוגדנים הנקשרים לציטוצינים מתילציה כדי להעשיר עבור רצפי DNA מתילציה.

לבסוף, ניתוח bisulfite משמש כדי להבחין מתילאט מציטוסין ללא ממותיל ב- DNA, על ידי ביצוע תגובה כימית הממירה ציטוסין ללא ממתיל לאורסיל. לאחר המרה זו, DNA שטופלו ביסולפיט יכול להיות נתון PCR, רצף, לעומת גנום התייחסות. ציטוצינים לא מתולבטים הם אלה הנמצאים בהתייחסות, אך מוחלפים בטימין בעקבות ניתוח ביסולפיט ו- PCR. על ידי חשיפת DNA שטופל ביסולפיט לספקטרומטריית מסה, חוקרים יכולים גם ליצור "אפיגרמות מתילציה", המייצגות באופן ליניארי CPGs שונים בגנום ומתארות את מידת המתילציה בכל אחד מהם. אפיגרמות כאלה שימושיות במיוחד אם החוקרים רוצים להשוות דפוסי מתילציה בין סוגי תאים שונים.

בואו עכשיו נסתכל לעומק על הפרוטוקול לניתוח ביסולפיט.

בתור התחלה, נתרן הידרוקסיד מתווסף תכשירים של DNA גנומי, אשר לאחר מכן דגירה ב 95 מעלות צלזיוס. זה מגנה את הדנ"א והופך את בסיסיו לנגישים לתגובות כימיות עוקבות. נתרן מטאביסולפיט הוא הציג לאחר מכן לתוך תערובת DNA denatured, ושני שלבי תגובה כימית יתרחשו. במהלך השלב הראשון, גופרתי, קבוצת סולפיט מתווספת לציטוסין ללא תיל כדי ליצור ציטוסין סולפונט. לאחר מכן, במהלך deamination הידרולי, קבוצת אמינו מוסר ציטוסין גופרונאט כדי ליצור אורסיל גופרתי.

כדי להקל על השלבים הראשונים של התגובה הכימית, הכנת ה- DNA היא overlain עם שמן מינרלי, אשר מונע אידוי ומסייע לשמור על ריכוז של נתרן metabisulfite. התגובה היא אז דגירה ב 55°C בחושך. במהלך שלב זה, סוכן כדי למנוע חמצון, כגון quinol, מתווסף גם לתערובת.

כדי לאסוף דנ"א מותאם המכיל אורסיל גופרתי, וללא שמן מינרלי, התערובת היא צנטריפוגה והשכבה הנוזלית הנמוכה ביותר התאוששה. הדנ"א בתמיסה זו מטוהר.

לאחר מכן, נתרן הידרוקסיד מתווסף לתערובת ה- DNA, אשר לאחר מכן דגירה ב 37 °C. הדבר נעשה כדי לגרום לדסולפונציה, אשר - כפי שאולי ניחשתם - מסיר את קבוצת הגופרית מ-uracil sulfonate, יוצר אורסיל ומשלים את התגובה הכימית.

לבסוף, התערובת מנוטרלת עם תוספת של אצטט אמוניום, ואת ה- DNA נאסף על ידי משקעים אתנול. לאחר שהדנ"א שעבר ביסולפיט מטוהר, הוא נתון ל-PCR ולרצף.

כעת, לאחר שדיברנו על הטכניקה הבסיסית לניתוח ביסולפיט, בואו נבחן כמה יישומים ניסיוניים.

חלק מהחוקרים משתמשים בניתוח ביסולפיט כדי לחקור הטבעה גנומית. כאן, החוקרים חצו שני זנים של Arabidopsis עם הבדלים גנטיים, כך DNA אימהי ו אבהי ניתן להבחין. דפוסי מתילציה בעוברים המתקבלים ובאנדוספרם הקשורים, או ברקמה התומכת בעובר, הושוו לאחר מכן. באמצעות שיטה זו, מדענים מצאו כי CPGs באלל האימהי של גן קידוד חלבון, MEA, נטו להיות מתיל בעוברים אבל unmethylated אנדוספרם, המציין הטבעה ספציפית לרקמות.

חוקרים אחרים משתמשים בטכניקה זו כדי להבין כיצד גורמים סביבתיים או חברתיים יכולים לשנות דפוסי מתילציה. כאן, גורי עכברים הופרדו מאמהותיהם כדי לגרום ללחץ, ורקמות המוח שלהם היו מבודדות לאחר מכן. לאחר רצף של DNA שטופלו ביסולפיט, מדענים קבעו כי דפוסי מתילציה בגן קידוד הורמונלי, AVP, השתנה באזור מוח מסוים גורים "מופרדים", דבר המצביע על מנגנון מולקולרי אפשרי להשפעות ביולוגיות ארוכות טווח של ניסיון חיים מוקדם.

לבסוף, חוקרים רבים מנסים לייעל ניתוח bisulfite כדי להקל על ההשוואה של דפוסי מתילציה בין תאים בודדים, ייחודיים. כאן, החוקרים שינו את שיטת ניתוח הביסולפיט כך שכל השלבים בוצעו על ביציות עכבר בודדות המוטמעות באגרוז, מה שעזר להגן מפני אובדן DNA. בשיטה זו, החוקרים הצליחו לזהות בקלות דגימות ביציות בודדות שזוהמו בתאים אחרים על ידי חיפוש אלה שנתנו דפוסי מתילציה מרובים.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על ניתוחים רגישים לתילציה. כאן, דנו בתפקיד שמתילציה DNA ממלאת בוויסות גנים, שיטות שהחוקרים משתמשים כדי לזהות אזורים מתילציה בגנום, פרוטוקול כללי לניתוח ביסולפיט, ולבסוף, כמה יישומים של טכניקה זו. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter