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Análise de Metilação de DNA
 
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Análise de Metilação de DNA

Overview

A metilação em dinucleotídeos cpG é uma modificação química do DNA hipótese para desempenhar papéis importantes na regulação da expressão genética. Em particular, a metilação de aglomerados de locais de metilação, chamados de "ilhas CpG", perto de promotores e outros elementos regulatórios genéticos pode contribuir para o silenciamento estável dos genes, por exemplo, durante processos epigenéticos como impressão genômica e inativação do cromossomo X. Ao mesmo tempo, a metilação aberrante do CpG tem se mostrado associada ao câncer.

Neste vídeo, serão apresentadas as funções biológicas e mecanismos da metilação do DNA, juntamente com diversas técnicas utilizadas para identificar locais de metilação no genoma. Examinaremos então as etapas da análise de bisulfito, um dos métodos mais utilizados para detectar a metilação de DNA, bem como várias aplicações desta técnica.

Procedure

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A metilação do DNA é uma modificação química do DNA que afeta a expressão genética em diferentes contextos celulares. Muitos pesquisadores estão interessados no mecanismo e funções desse processo, já que a metilação do DNA aberrante tem sido associada a doenças como o câncer.

Neste vídeo, abordaremos os princípios por trás da metilação do DNA e métodos para detectá-lo. Em seguida, vamos explorar um protocolo geral para um desses métodos, análise de bisulfeto, e algumas aplicações desta técnica.

Primeiro, vamos dar uma olhada no que é a metilação de DNA e como ela pode ser detectada.

Durante este processo bioquímico, uma célula adiciona uma etiqueta química conhecida como grupo de metila às bases de citosina em seu DNA. A maioria das citosinas metiladas ocorrem ao lado de bases de guanina na mesma cadeia de DNA, e esses nucleotídeos adjacentes — e a ligação de fosfodiester que as liga — são chamados de "CpGs". Embora a maioria dos CpGs vertebrados sejam metilados, aqueles que não são metilados tendem a ocorrer juntos em "ilhas" cpG perto dos promotores de genes ativamente expressos, e vários outros elementos de sequência regulatória.

Como as mudanças na metilação do DNA contribuem para a regulação genética ainda é objeto de intensa investigação. A metilação das ilhas CpG parece ser importante para o silenciamento genético estável e de longo prazo visto em processos epigenéticos como a impressão genômica, que é a expressão específica pai de origem de certos genes, bem como a inativação do cromossomo X, o silenciamento de um dos dois cromossomos X em cada célula de mamíferos fêmeas. A repressão de genes críticos devido à metilação aberrante das ilhas CpG também tem sido demonstrada para contribuir para o crescimento celular descontrolado, que pode levar ao câncer. Mecanicamente, a metilação do DNA pode contribuir para o silenciamento genético, impedindo que fatores de transcrição se assemelham aos promotores, ou recrutando proteínas que modificam histones e remodelam a cromatina em um estado transcricionralmente não permissivo.

Existem vários métodos para detectar o estado de metilação do DNA.

Uma técnica, o ensaio HELP, envolve duas endonucleases de restrição chamadas HpaII e MspI, que respectivamente apenas se formam, ou ambas metiladas e não metiladas, sequências CCGG. Comparando os padrões de digestão produzidos por essas duas enzimas, o estado de metilação do DNA pode ser deduzido.

Outro método, chamado imunoprecipitação de DNA metilado ou "MeDIP", usa anticorpos que se ligam a citosinas metiladas para enriquecer para sequências de DNA metilado.

Finalmente, a análise de bisulfita é usada para distinguir a citosina não metilada no DNA, realizando uma reação química que converte citosina não metilada em uracil. Após esta conversão, o DNA tratado por bisulfato pode ser submetido a PCR, sequenciado e comparado a um genoma de referência. Citosinas não metiladas são aquelas que estão presentes na referência, mas substituídas por timinas após análise de bisulfito e PCR. Submetendo o DNA tratado de bissulfeto à espectrometria de massa, os pesquisadores também podem criar "epigramas de metilação", que representam linearmente diferentes CpGs no genoma e retratam o grau de metilação em cada um deles. Tais epigramas são particularmente úteis se os pesquisadores desejam comparar padrões de metilação entre diferentes tipos de células.

Vamos agora dar uma olhada aprofundada no protocolo de análise de bisulfato.

Para começar, hidróxido de sódio é adicionado às preparações de DNA genômico, que são então incubados a 95°C. Isso desnatura o DNA e torna suas bases acessíveis a reações químicas subsequentes. Metabissulfeto de sódio é então introduzido na mistura de DNA desnaturado, e duas etapas de reação química ocorrerão. Durante a primeira etapa, sulfonação, um grupo de sulfite é adicionado a uma citosina não metilada para formar sulfonato de citosina. Em seguida, durante a deaminação hidrolicada, um grupo de amino é removido do sulfonato de citosina para gerar sulfonato uracil.

Para facilitar esses primeiros estágios da reação química, a preparação do DNA é sobreposta com óleo mineral, o que previne a evaporação e ajuda a manter a concentração de metabisullfita de sódio. A reação é então incubada a 55°C no escuro. Durante esta etapa, um agente para evitar a oxidação, como quinol, também é adicionado à mistura.

Para coletar DNA modificado contendo sulfonato uracil, e sem óleo mineral, a mistura é centrifuada e a camada líquida mais baixa recuperada. O DNA desta solução é então purificado.

Em seguida, hidróxido de sódio é adicionado à mistura de DNA, que é então incubada a 37°C. Isso é feito para induzir a desulfonação, que , como você deve ter adivinhado, remove o grupo sulfite do sulfonato uracil, formando uracil e completando a reação química.

Finalmente, a mistura é neutralizada com a adição de acetato de amônio, e o DNA é coletado pela precipitação do etanol. Uma vez que o DNA convertido por bisulfita tenha sido purificado, ele é submetido a PCR e sequenciamento.

Agora que discutimos a técnica básica para análise de bisulfato, vamos olhar para algumas aplicações experimentais.

Alguns pesquisadores usam a análise de bisulfato para investigar a impressão genômica. Aqui, os pesquisadores cruzaram duas cepas de Arabidopsis com diferenças genéticas, para que o DNA materno e paterno pudesse ser distinguido. Os padrões de metilação nos embriões resultantes e no endosperm associado, ou no tecido que sustenta o embrião, foram então comparados. Usando este método, os cientistas descobriram que os CpGs no alelo materno de um gene codificador de proteínas, MEA,tendiam a ser metilados em embriões, mas não metilados em endosperma, indicando impressão específica do tecido.

Outros pesquisadores estão usando essa técnica para entender como fatores ambientais ou sociais podem alterar padrões de metilação. Aqui, filhotes de rato foram separados de suas mães para induzir o estresse, e seus tecidos cerebrais foram posteriormente isolados. Após o sequenciamento do DNA tratado com bisulfita, os cientistas determinaram que os padrões de metilação em um gene codificador de hormônios, AVP,mudaram em uma região cerebral específica em filhotes "separados", sugerindo um possível mecanismo molecular para efeitos biológicos de longo prazo da experiência de vida precoce.

Finalmente, muitos pesquisadores estão tentando otimizar a análise de bisulfato para facilitar a comparação de padrões de metilação entre células individuais e únicas. Aqui, os pesquisadores modificaram o método de análise de bisullfita para que todas as etapas fossem realizadas em oócitos individuais de camundongos embutidos em agarose, o que ajudou a se proteger contra a perda de DNA. Usando esse método, os pesquisadores foram capazes de identificar facilmente amostras de oócito único que haviam sido contaminadas com outras células, procurando por aquelas que deram múltiplos padrões de metilação.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre análises sensíveis à metilação. Aqui, discutimos o papel que a metilação de DNA desempenha na regulação genética, métodos que os pesquisadores usam para identificar regiões metiladas no genoma, um protocolo generalizado para análise de bisulfato, e, finalmente, algumas aplicações dessa técnica. Como sempre, obrigado por assistir!

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