خلايا تمتلك البضائع الآلات الاتجار لنقل مواد مثل بروابط، والكائنات الدقيقة، والمغذيات، والبروتينات في الغشاء الخلية للحصول على معلومات، والطاقة، وغيرها من الأغراض 1، 2 خارج الخلية. ومن الأهمية بمكان للالتوازن الخلوي، وظيفة الأنسجة، وبقاء الخلية بشكل عام. التعبير القائم على خلية من البروتينات الانصهار فلوري هو وسيلة قوية لدراسة توطين واستيعاب مستقبلات الغشاء، مثل G مستقبلات البروتين يقترن (GPCR)، في مسارات الإشارات 3.
وقد اكتسب التعبير عن البروتينات الانصهار ذات الكلمات الدلالية مع الأخضر بروتين فلوري (GFP) من فيكتوريا قنديل البحر Aequorea، جنبا إلى جنب مع تقنيات الكشف عن مضان المباشر، قبولا واسعا في استهداف بروتين البحوث 4، 5، 6. detecti القائم GFPعلى ديها ميزة تسمح للتصوير في الوقت الحقيقي من الخلايا الحية مع تجنب القطع الأثرية تثبيت 7. وقد تم بناؤها سلسلة من ناقلات الاستنساخ متعددة لتسهيل التعبير عن اندماج البروتين GFP في مختلف خلايا 8 و 9. متجه pEGFP-N1 هو متجه البلازميد تستخدم على نطاق واسع وتسويقها ترميز لتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP)، والتي تم الأمثل من النوع البري GFP لأكثر إشراقا مضان والتعبير العالي في خلايا الثدييات. لمراقبة أعربت إشارة الفلورسنت من EGFP في خلايا الثدييات، ينبغي إجراء الفحص المجهري مضان مع الإثارة في 488 نانومتر، وانبعاث في 507 نانومتر، ويفضل مع المجهر متحد البؤر.
رصد توطين التحت خلوية واستيعاب بوساطة يجند مستقبلات هي تقنية مشتركة للتحقيق في نقل الإشارة وظيفة GPCRs 10 11. في معظم الحالات، واستيعاب يؤدي إلى الحساسية من GPCRs (تخفيف من الاستجابة التحفيز على الرغم من وجود منبهات) 12، 13. ويمكن إدراج المستقبلات المنضوية في يحلول والمتدهورة، أو أنها يمكن إعادة تدويرها مرة أخرى إلى سطح الخلية، وهذا يتوقف على طبيعة المستقبلات وخطوط الخلايا المستخدمة في التجارب.
مستقبلات هرمون موجهة الغدد التناسلية الافراج عن (GnRHRs) تنتمي إلى عائلة GPCR ولديها بنية البروتين GPCR نموذجي، مع محطة الأمينية خارج الخلية، محطة -COOH داخل الخلايا، وسبعة الغشاء (TM) 14 المجالات. وأفاد ترنسفكأيشن البلازميد المؤتلف صج GnRHR-EGFP (مع الجين GnRHR من Sepiella تفرضه اليابان) وكشف الفحص المجهري متحد البؤر من الموسومة EGFP صج GnRHR (معبرا في الخلايا HEK293) بريفيوخبيث، وتأسست مضان GFP كمراسلة للبروتين الغشاء فحوصات توطين 15. الآن، واستيعاب صج GnRHR، تفعيلها من خلال S. الجابونيكا بين الافراج عن هرمون موجهة الغدد التناسلية (SJ نره])، وقد تجلى في الأدب زمنية وتعتمد على الجرعة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.
الهدف العام من هذه التجربة هو توفير طريقة فعالة وسهلة التفسير للكشف عن التموضع تحت الخلوي والاستيعاب الداخلي لبروتينات الاندماج GPCR المعبر عنها في الخلايا الثديية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التموضع البروتيني تحت الخلوي، مثل الاستيعاب الداخلي للمستقبلات وإعادة تدويرها. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية استخدامها بسهولة وكفاءة.
وبذلك يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية دقيقة في مراقبة وتحديد مواقع الـ GPCRs. كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى، مثل البروتينات السيتوبلازمية والنووية. بعد استعادة خلايا HEK293 وتمريرها وفقاً للبروتوكول النصي، وعندما تنمو الخلايا لتصل إلى مرحلة قريبة من التلاقي، تخلص من وسط النمو المتوازن، وأضف 2 mL من PBS، ثم قم بتحريك الطبق بشكل دائري لغسل الخلايا.
تخلص من محلول PBS، وأضف 1 ml من trypsin EDTA. ولهضم الخلايا تماماً، قم بتحريك الطبق بلطف بحركة دائرية ثم اسحب المحلول. بعد ذلك، ضع الطبق في حاضنة C02 ذات غلاف مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة ثلاث دقائق.
أثناء تحضين الخلايا، قم بتجهيز طبق مكون من ستة آبار عن طريق إضافة 2 mL من وسط النمو المتوازن إلى كل بئر. بعد ذلك، عندما تنفصل الخلايا عن قاع الطبق، أضف 1 mL من وسط النمو المتوازن إلى الطبق. اخلط المزيج باستخدام الماصة، ثم انقل على الفور 0.1 mL من معلق الخلايا إلى كل بئ