细胞具有货物运输机制，可将胞外物质（如配体、微生物、营养物质和跨膜蛋白）转运至细胞内，以获取信息、能量及其他用途1,2。这一过程对于细胞稳态、组织功能以及细胞整体存活至关重要。利用细胞表达荧光融合蛋白是研究跨膜受体（如G蛋白偶联受体，GPCR）在信号通路中的定位与内化过程的一种有力方法3。
利用来自维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）的绿色荧光蛋白（GFP）标记融合蛋白，并结合直接荧光检测技术，已在蛋白质靶向研究中得到广泛应用4,5,6。基于GFP的检测方法具有可在活细胞中实时成像的优势，同时避免了固定所导致的人工假象7。目前已构建一系列多功能克隆载体，以促进在多种细胞中表达与GFP融合的蛋白质8,9。pEGFP-N1载体是一种广泛应用且已商业化的质粒载体，编码经优化的增强型绿色荧光蛋白（EGFP），其相较于野生型GFP在哺乳动物细胞中具有更强的荧光信号和更高的表达水平。为观察在哺乳动物细胞中表达的EGFP荧光信号，应采用488 nm激发光和507 nm发射光进行荧光显微镜检测，优先使用共聚焦显微镜。
监测受体的亚细胞定位及其配体介导的内化是研究G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导与功能的常用技术10,11。在大多数情况下，内化会导致GPCR脱敏（即尽管激动剂存在，刺激反应仍减弱）12,13。内化的受体可被转运至溶酶体并降解，也可被循环回收至细胞膜表面，具体命运取决于受体的性质及实验中所用的细胞系。
促性腺激素释放激素受体（GnRHRs）属于G蛋白偶联受体（GPCR）家族，具有典型的GPCR蛋白结构，包括一个细胞外氨基末端、一个细胞内-COOH末端以及七个跨膜（TM）结构域14。先前已有报道，将重组质粒SjGnRHR-EGFP（包含来自Sepiella japonica的GnRHR基因）转染至细胞，并通过共聚焦显微镜检测在HEK293细胞中表达的EGFP标记的SjGnRHR，同时已确立GFP荧光作为跨膜蛋白定位实验的报告信号15。目前，通过共聚焦显微镜观察发现，由中国台湾S. japonica促性腺激素释放激素（SjGnRH）激活的SjGnRHR内化过程呈现出时间和剂量依赖性。
本实验的总体目标是提供一种高效且易于解读的方法，用于检测哺乳动物细胞中表达的G蛋白偶联受体（GPCR）融合蛋白的亚细胞定位及其内化情况。该方法有助于回答亚细胞蛋白定位研究领域中的关键问题，例如受体的内化与再循环。该技术的主要优势在于其操作简便且效率高。
因此，该方法可为监测和定位G蛋白偶联受体（GPCRs）提供见解，并可应用于其他系统，如细胞质和核蛋白。按照文本方案复苏并传代HEK293细胞后，当细胞生长至接近汇合时，弃去预温的培养基，加入两毫升磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻晃动培养皿以洗涤细胞。
弃去 PBS，加入 1 毫升胰蛋白酶 EDTA。为完全消化细胞，轻轻晃动培养皿后吸除溶液。随后，将培养皿置于 37 摄氏度水套式 CO2 培养箱中孵育 3 分钟。
在细胞孵育的同时，向六孔板的每个孔中加入两毫升平衡过的培养基，进行准备。当细胞从培养皿底部脱落时，向培养皿中加入一毫升平衡过的培养基。用移液器吹打混匀，并立即向已准备好的六孔板的每个孔中转移0.1毫升细胞悬液。
轻轻吹打各孔中的悬液，并将细胞在37摄氏度、5% CO2条件下孵育。次日，确保细胞融合度达到85–95%。然后，向两个无菌微量离心管中，向其中一管加入3微克质粒DNA和100微升低血清培养基。
同时，向另一支试管中加入9微升试剂一和100微升低血清培养基。将试管在室温下孵育5分钟。将稀释的质粒混合物与稀释的试剂一混合。
然后轻轻混匀溶液，在室温下孵育20分钟。吸除细胞培养基，每孔加入1.5毫升不含FBS的新鲜DMEM培养基。随后，将215微升DNA转染试剂混合物逐滴加入每孔中，并通过轻轻摇动培养板进行混匀。
将培养板置于37摄氏度、5%CO2条件下孵育4至8小时。随后更换为含10%FBS的新鲜DMEM培养基。在进行任何实验前，继续培养细胞24至48小时。
不同细胞系的转染效率可能存在显著差异，因此可能需要根据所使用的特定细胞类型优化显微注射与刺入式沉积参数。从六孔培养板中移除生长培养基。
然后，用1毫升PBS洗涤细胞单层。加入0.5毫升胰蛋白酶EDTA，轻轻晃动培养皿，吸除溶液。随后，将培养板在37°C条件下孵育3分钟。
孵育期间，将直径为15毫米的无菌盖玻片插入12孔板的每个孔中。用少量新鲜的完全培养基重悬细胞，并将所需数量的细胞转移至含有盖玻片的12孔板中。然后，将细胞孵育16至24小时。
孵育16至24小时后，当细胞生长接近汇合时，向每个孔中加入5 µM的膜探针dill，然后将细胞放回孵育箱中继续孵育30分钟。移除已平衡的生长培养基，用冷的PBS洗涤细胞两次。随后，向每个孔中加入1 mL的4% PFA，在摇床上振荡15分钟以固定细胞。
用 PBS 洗涤固定后的细胞两次，然后向每个孔中加入 200 至 300 微升 DAPI，于室温孵育 10 分钟。再次用 PBS 洗涤细胞两次后，小心从板中取出盖玻片，并吸去多余的缓