Rilevamento di Ligand-activated proteina G-recettore accoppiato internalizzazione da microscopia confocale

Cellule possiedono macchine traffico merci da trasportare extracellulare materiali, ad esempio leganti, microrganismi, nutrienti e proteine transmembrana-nella cella per informazioni, energia e altri scopi ^{1, 2.} È fondamentale per l'omeostasi cellulare, la funzione dei tessuti, e la sopravvivenza delle cellule complessiva. L'espressione a base di cellule di proteine di fusione fluorescenti è un potente strumento per studiare la localizzazione e internalizzazione di recettori transmembrana, come G recettori accoppiati alle proteine (GPCR), in vie di segnalazione ^3.

L'espressione di proteine di fusione contrassegnate con proteina fluorescente verde (GFP) dalla medusa Aequorea victoria, combinato con tecniche di rivelazione di fluorescenza diretta, ha guadagnato un largo consenso nel proteina-targeting di ricerca ^{4, 5, 6.} detecti GFP-basedsulla presenta il vantaggio di consentire l'imaging in tempo reale delle cellule viventi evitando artefatti fissaggio ^7. Una serie di vettori di clonaggio versatili è stato costruito per facilitare l'espressione di proteine per fusioni GFP in varie cellule ^{8, 9.} Il vettore pEGFP-N1 è un vettore plasmidico utilizzato e commercializzato codificante una maggiore proteina fluorescente verde (EGFP), che è stato ottimizzato da wild-type per GFP luminosa fluorescenza e più alta espressione in cellule di mammifero. Per osservare il segnale fluorescente EGFP espresso in cellule di mammifero, la microscopia a fluorescenza deve essere condotta con l'eccitazione a 488 nm e l'emissione a 507 nm, preferibilmente con microscopia confocale.

Monitoraggio della localizzazione subcellulare e internalizzazione ligando mediata da recettori è una tecnica comune per indagare la trasduzione del segnale e funzione della GPCR ¹⁰ up>, ^11. Nella maggior parte dei casi, porta alla internalizzazione desensibilizzazione dei GPCR (l'attenuazione della risposta stimolo nonostante la presenza di agonisti) ^{12, 13.} I recettori internalizzati possono essere incorporati nella lisosoma e degradati, oppure possono essere riciclati alla superficie cellulare, a seconda della natura dei recettori e le linee cellulari utilizzate negli esperimenti.

I recettori dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRHRs) appartengono alla famiglia GPCR e hanno una struttura tipica proteina GPCR, con un terminale ammino extracellulare, un terminale -COOH intracellulare, e sette transmembrana (TM) ¹⁴ domini. La trasfezione di plasmidico ricombinante Sj GnRHR-EGFP (con il gene GnRHR da Sepiella japonica) e la rilevazione di microscopia confocale GnRHR Sj EGFP-tag (espressi in cellule HEK293) è stata riportata Precemalizioso, e la fluorescenza GFP è stato stabilito come reporter per saggi di localizzazione della proteina transmembrana ^15. Ora, l'interiorizzazione di Sj GnRHR, attivato da S. japonica gonadotropina-releasing hormone (GnRH Sj), è stata dimostrata in maniere tempo-e dose-dipendenti mediante microscopia confocale.