共焦点顕微鏡により、リガンド活性化Gタンパク質共役型受容体内在化の検出

細胞は、情報、エネルギー、及び他の目的の^1、2についての細胞内タンパク質、細胞外物質、例えばリガンド、微生物、栄養素、および膜貫通などを輸送する貨物輸送の機構を有します。それは、細胞の恒常性、組織機能、および全体的な細胞の生存に重要です。蛍光融合タンパク質の細胞ベースの発現は、経路^{3シグナリング}に、そのようなGタンパク質共役受容体（GPCR）のような膜貫通受容体の局在化および内在化を研究するための強力な方法です。

直接蛍光検出技術と組み合わせクラゲオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（GFP）でタグ付けされた融合タンパク質の発現は、タンパク質-ターゲティング研究^4、5、6で広く受け入れられています。 GFPベースdetecti固定アーティファクト^7を回避しながら、生細胞のリアルタイムイメージングを可能にするという利点を有します。汎用性のクローニングベクター一連の種々の細胞^8,9にGFPにタンパク質融合物の発現を促進するように構成されています。 pEGFP-N1ベクターは、哺乳動物細胞におけるより明るい蛍光およびより高い発現のために、野生型GFPから最適化された増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）をコードして広く使用され、市販されているプラ​​スミドベクターです。 EGFPの蛍光シグナルは、哺乳動物細胞において発現を観察するために、蛍光顕微鏡は、好ましくは、共焦点顕微鏡では、488 nmでの励起および507 nmでの発光を用いて行われるべきです。

受容体の細胞内局在、およびリガンド媒介性内在化を監視することのGPCR ¹⁰のシグナル伝達および機能を調査する一般的な技術であります^11、>アップ。ほとんどの場合、内在化は、GPCRの脱感作（アゴニストの存在にもかかわらず、刺激応答の減衰^）12、13を導きます。内在化受容体は、リソソームおよび劣化に組み込むことができ、またはそれらは、受容体との実験で使用した細胞株の性質に応じて、細胞表面に再循環させることができます。

ゴナドトロピン放出ホルモン受容体（GnRHRs）はGPCRファミリーに属し、細胞外アミノ末端を有する典型的なGPCRタンパク質構造、細胞内-COOH端子、7つの膜貫通^（TM）14ドメインを有します。 （SepiellaジャポニカからGnRHR遺伝子を有する）組換えプラスミドのSJ GnRHR-EGFPのトランスフェクションおよび（HEK293細胞に発現）EGFPタグのSJ GnRHRの共焦点顕微鏡検出をpreviouを報告しました。SLY、そしてGFP蛍光は、膜貫通タンパク質の局在化アッセイ¹⁵のためのレポーターとして設立されました。今、S.ジャポニカゴナドトロピン放出ホルモン（SjとのGnRH）によって活性化さSjの GnRHRの内部移行は、共焦点顕微鏡によって時間および用量依存的様式で実証されました。