Hücreler taşımak için yük trafik mekanizmalara sahip hücre dışı malzemeler-tür ligandlar, mikroorganizmalar, besin ve zar-ötesi proteinden-bir bilgi, enerji ve diğer amaçlar 1, 2 hücre olarak. Hücresel homeostazı, doku işlevinin ve genel hücrenin hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Floresan füzyon proteinlerinin hücre bazlı ekspresyon yolları 3 sinyal lokalizasyonu ve G-protein bağlı reseptörler (GPCR), transmembran reseptörleri, internalizasyonunu incelemek için etkili bir yoldur.
Doğrudan floresans saptama teknikleri ile bir arada Aequorea victoria akvaryum balığındaki yeşil floresan protein (GFP) ile etiketlenmiş füzyon proteinlerinin ekspresyonu, geniş kabul görmüştür protein gibi araştırma 4, 5, 6. GFP tabanlı Detectiüzerinde sabitleme eserler 7 kaçınırken yaşayan hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleme izin verme avantajına sahiptir. Çok yönlü klonlama vektörleri bir dizi, 9, çeşitli hücrelerde 8 GFP protein füzyonlarının ekspresyonunu kolaylaştırmak için inşa edilmiştir. pEGFP-N1 vektörü memeli hücrelerinde daha parlak floresans ve daha yüksek ifadesi için doğal tipte GFP arasından optimize edilmiş olan bir arttırılmış yeşil fluoresan protein (EGFP) kodlayan yaygın olarak kullanılan ve ticari olarak plazmid vektörüdür. EGFP flüoresan sinyal memeli hücrelerinde ifade gözlemlemek için, floresans mikroskopisi tercihen eş odaklı mikroskopi ile 488 nm'de eksitasyon ve 507 nm'de emisyon ile yapılmalıdır.
Hücre içi lokalizasyonu ve reseptörlerin ligand aracılı içselleştirme İzleme GPCR'lerin 10 sinyal iletimini ve araştırmak üzere yaygın bir tekniktir 11,> yukarı. Bir çok durumda, internalizasyonunu GPCR'lerin duyarsızlaştırma (agonistlerin mevcudiyetinde rağmen teşvik cevabının hafifleme) 12, 13 neden olmaktadır. içsel reseptörleri lizozom dahil edilmiş ve bozulmuş ya da reseptörler ve deneylerde kullanılan hücre çizgilerinin yapısına bağlı olarak, hücre yüzeyine geri geri dönüştürülebilir edilebilir.
Gonadotropin salgılatıcı hormon reseptörleri (GnRHRs) GPCR familyasına aittir ve hücre dışı bir amino-terminali, bir hücre içi -COOH terminal ile, tipik bir GPCR protein yapısına sahip ve yedi zar-ötesi (TM) 14 alanlarla kullanılabilir. (Sepiella japonica gelen GnRHR geni ile) yeniden birleştirici plazmit Sj GnRHR-EGFP transfeksiyonu ve (HEK293 hücrelerinde ifade edilir) EGFP-etiketli Sj GnRHR konfokal mikroskopi tespit Previou bildirilmiştirsinsi ve GFP floresan transmembran protein lokalizasyonu deneyleri 15 muhabir olarak kurulmuştur. Şimdi, S. japonica gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH Sj) ile aktive Sj GnRHR içselleştirilmesi, eş odaklı mikroskopi ile zaman ve doza bağlı şekillerde gösterilmiştir.
Bu deneyin genel amacı, memeli hücrelerde eksprese edilen GPCR füzyon proteinlerinin hücre altı lokalizasyonunu ve internalizasyonunu tespit etmek için verimli ve kolayca yorumlanabilir bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem, reseptör internalizasyonu ve geri dönüşümü gibi hücre altı protein lokalizasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kolay ve verimli bir şekilde kullanılabilmesidir.
Böylece bu yöntem, GPCR'lerin izlenmesi ve konumlandırılmasına dair içgörü sağlayabilir. Ayrıca, sitoplazmik ve nükleer proteinler gibi diğer sistemler için de uygulanabilir. HEK293 hücreleri metin protokolüne göre geri kazanılıp pasajlandıktan sonra, hücreler yaklaşık konfluense ulaştığında, dengelenmiş büyüme ortamını dökün, iki mililitre PBS ekleyin ve hücreleri yıkamak için kabı dairesel hareketlerle sallayın.
PBS'yi dökün ve bir mililitre trypsin EDTA ekleyin. Hücrelerin tamamen sindirilmesi için kapla dikkatlice dairesel hareketler yapın ve solüsyonu aspire edin. Ardından, kabı 37 °C sıcaklıktaki su ceketli CO2 inkübatörüne üç dakika boyunca yerleştirin.
Hücreler inkübe olurken, her bir kuyucuğa iki mililitre dengelenmiş büyüme besiyeri ekleyerek a