Overview
Una de las herramientas más utilizadas en la biología moderna es molecular clonación con enzimas de restricción, que crear extremos compatibles entre fragmentos de ADN que puedan ser Unidas. Sin embargo, esta técnica tiene ciertas restricciones que limitan su aplicabilidad para la generación de construcción de ADN grande o complejo. Una técnica más nueva que se ocupa de algunas de estas deficiencias es recombineering, que modifica el ADN mediante recombinación homóloga (HR), el intercambio entre diferentes moléculas de ADN basado en tramos de secuencias idénticas o similares. Junto con gene targeting, que aprovecha recursos humanos endógenos para alterar el genoma de un organismo en un locus específico, basado en recursos humanos técnicas de clonación han mejorado notablemente la velocidad y la eficacia de la ingeniería genética de alto rendimiento.
En este video, presentamos los principios de recursos humanos, así como los componentes básicos necesarios para realizar un experimento recombineering, incluyendo organismos competente recombinación y las bibliotecas genómicas como cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Luego caminamos a través de un protocolo que utiliza recombineering para generar un vector gene targeting que en última instancia ser transfected en las células madre embrionarias para generar un animal transgénico. Por último, se presentarán varias aplicaciones que ponen de relieve la utilidad y la variedad de técnicas recombineering.
Procedure
Clonación por recombinación homóloga o recombineering, ha mejorado enormemente la capacidad de los investigadores para llevar a cabo ingeniería de genética de alto rendimiento. Clonación molecular clásica requiere digestión de vectores y se inserta con las mismas enzimas de restricción para generar extremos compatibles para "recombinación", pero especialmente cuando se trata de aislar una región de una secuencia más larga, como un estiramiento de la DNA genomic, no siempre hay enzimas de restricción que corta únicamente la región de interés y no dentro de la región o en otros lugares en la secuencia. Evitando la necesidad de estos sitios de restricción, recombineering proporciona una manera mucho más eficiente y rentable para hacer construcciones de ingeniería genética.
En este video, se introducen los principios de la recombinación genética, proporcionan un protocolo general para recombineering un vector gene targeting y discutir varias aplicaciones de estas tecnologías.
En primer lugar, vamos a discutir qué recombinación es y cómo se puede aplicar.
Recombinación genética implica el intercambio de información entre las moléculas de ADN. En la "recombinación homóloga", se intercambian relativamente grandes extensiones de secuencias de ADN similares o idénticas. Las células utilizan este proceso para reparar roturas de cadena doble, y eucariotas sexual reproducción también realizan esto entre cromosomas homólogos durante la meiosis para aumentar la diversidad genética.
Recombinación homóloga ha sido aprovechado para un número de propósitos experimentales, incluyendo la modificación de determinados loci endógenas en las células, llamado "gene targeting". También se aplica a la ingeniería de construcciones genéticas, un proceso llamado "recombineering", que es especialmente útil para hacer modificaciones a grandes trechos de ADN para apuntar al genoma de un organismo. Para ello, los investigadores pueden hacer uso de "bibliotecas genómicas", o conjuntos de vectores cada ADN largo genómico que contiene fragmentos. Varios tipos de bibliotecas con diversas capacidades, generalmente propagadas en clones bacterianos, se han creado y pueden solicitarse desde repositorios comerciales o sin fines de lucro. Uno de los tipos más utilizados de la biblioteca genómica se llama cromosoma artificial bacteriano o BAC, que puede llevar a un tamaño de inserto entre 150-350 kilobases.
A fin de recombineer una construcción, necesidad de los científicos, un organismo en el cual recombinación homóloga ocurre. La levadura Saccharomyces cerevisiae es naturalmente "recombinación competente" y puede fácilmente llevar a cabo la recombinación homóloga entre un vector e insertar. Otro sistema comúnmente aplicada utiliza las proteínas de "Rojo" del bacteriófago lambda, que se reconstituye en la bacteria e. coli. Vectores pueden ser recombineered en cepas bacterianas expresando rojo establecidas previamente, o un plásmido codificación componentes rojo pueden transformarse conjuntamente con los sustratos recombineering en las bacterias.
Ahora, vamos a caminar a través de un protocolo para crear un vector gene targeting por recombineering.
El objetivo de este protocolo es crear un ratón genéticamente modificado con los cambios dirigidos a un gen específico. Brevemente, deseado para el gen de interés modificaciones en una BAC; la secuencia modificada se "recupera" en un vector de objetivo, y este vector es transfected en las células madre embrionarias de gene targeting. Las células madre puede utilizarse entonces para generar animales modificados genéticamente. Para obtener instrucciones sobre este último procedimiento, consulte a la enseñanza de las Ciencias JoVE video "ingeniería genética de organismos modelo."
Para empezar, un clon BAC que contenga la secuencia genómica de interés es identificado y ordenado. A continuación, se diseñan los brazos de homología, u oligonucleótidos que contienen las regiones homólogas del basepair 30-50. Estos oligonucleótidos sirven como cebadores en reacciones de PCR para generar el ADN "cassettes" para modificar el gen de interés. Estas cintas contienen típicamente, por ejemplo, genes de resistencia a los antibióticos que pueden actuar como marcadores de selección, que pueden ampliarse fácilmente de muchos plásmidos disponibles al público. El clon bacteriano de BAC se transforma entonces, por ejemplo por la electroporación, con un plásmido de codificación de los componentes del sistema Red, seguidos de los casetes que contienen brazo de homología. Las bacterias luego se incuban a la temperatura adecuada para inducir la recombinación.
Para recuperar la secuencia modificada del BAC, un vector de "recuperación" es lineal y amplificada usando las cartillas que contienen armas de homología que cubren varios kilobases alrededor del sitio de modificación. Columna vertebral de este vector se transforma en el clon bacteriano de BAC, y recombineering se induce otra vez. El vector será "gap-reparado" por "recuperar" la secuencia apropiada del BAC. El resultado es un vector dirigido a gen que contiene la secuencia modificada de interés, así como las regiones homólogas de ADN genómico que rodean la secuencia modificada. Este vector puede purificada, lineal e introducido en las células madre embrionarias, donde el mecanismo de recombinación homóloga endógeno centrará en la secuencia modificada para el lugar geométrico correspondiente, alterando el genoma del anfitrión.
Ahora veamos algunas aplicaciones de técnicas de ingeniería basados en la recombinación.
En primer lugar, los investigadores pueden utilizar recombineering para rápida y fácilmente del genoma bacteriano, por ejemplo, para el estudio de complejos de la proteína. Aquí, un cassette una etiqueta de afinidad péptido secuencial así como un marcador de selección de resistencia kanamicina de codificación fue diseñado para ser recombineered en el extremo de ¢ 3 del gen de interés. Este vector se introdujo entonces en rojo "recombinación competente" e. coli, y éxito recombinantes fueron aislados usando medios selectivos. Los complejos proteína clasificada bioquímicamente se purificaron usando proteínas que se unen fuertemente a las etiquetas y analizan por espectrometría de masas para identificar a los socios de la interacción de la proteína de interés.
Recombineering y gene targeting pueden utilizarse también para modificar el genoma de organismos parasíticos, como el obligue parásito intracelular Toxoplasma gondii, que causa la toxoplasmosis enfermedad. En este estudio, un vector de objetivo fue recombineered en levaduras, donde secuencias genómicas que flanquean el gen de interés se colocaron alrededor de un marcador de selección. El vector entonces fue linearizado y electroporated en los parásitos. Limitación de dilución en placas de medios selectivos se utilizó para aislar éxito recombinantes, en el cual maquinaria de recombinación homóloga del parásito sustituye la secuencia genomic con la secuencia diseñada, por lo tanto eliminar el gen de interés. PCR de la región destinada había confirmado eventos de recombinación positivo.
Por último, un procedimiento conocido como subcloning más inserción o SPI, se ha ideado que inserción de reparación y cassette de brecha ocurren simultáneamente, haciendo el proceso recombineering más simple y más flexible. Crítico para el éxito de este proceso es el adecuado diseño de la homología de múltiples brazos, que, a hasta 180 bp, estan más en recombineering convencional con el fin de aumentar la eficacia de la recombinación. Después de incorporar los brazos de homología en el plásmido subcloning y cassettes de inserción por PCR, juntos se transformaron en un clon BAC expresando rojo y recombineering fue inducida. Con éxito recombineered construcciones luego fueron identificadas por análisis PCR o restricción digest.
Sólo ha visto video de Zeus en recombineering. En este video, hemos discutido los principios de la recombinación y cómo pueden ser utilizados en la ingeniería genética, un protocolo para un proyecto recombineering y finalmente varias aplicaciones de estas técnicas. ¡Como siempre, gracias por ver!
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