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Overview

게놈에서 특정 서열을 수정하기위한 잘 확립 된 기술은 동종 재조합에 의해 유전자 표적화이지만,이 방법은 힘들 수 있으며 특정 유기체에서만 작동합니다. 최근의 어드밴스는 특정 서열을 인식하는 단백질 또는 RNA에 의해 게놈 부위를 표적으로 유도하는 엔지니어링 된 뉴클레아제 효소를 사용하여 DNA에서 이중 가닥 휴식을 유도하여 작동하는 "게놈 편집"의 개발로 이어졌습니다. 세포가 이 손상을 복구하려고 할 때, 돌연변이는 표적으로 한 DNA 지역으로 소개될 수 있습니다.

이 비디오에서 JoVE는 게놈 편집의 원리를 설명하며 이 기술이 DNA 수리 메커니즘과 어떻게 관련이 있는지 강조합니다. 그런 다음 아연 손가락 뉴클레아제, TALENs 및 CRISPR-Cas9 시스템과 같은 세 가지 주요 게놈 편집 방법을 검토하고 CRISPR을 사용하여 포유류 세포에서 표적 유전 적 변화를 만드는 프로토콜을 검토합니다. 마지막으로, 우리는 모형 유기체 또는 배양된 세포에 있는 유전 물질을 바꾸기 위하여 게놈 편집을 적용하는 몇몇 현재 연구를 토론합니다.

Procedure

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게놈 편집은 연구원이 특정 DNA 서열을 "편집"하거나 변경할 수 있는 기술을 포함합니다. 이 방법은 세포가 수시로 불완전하게 복구하는 것을 시도하는 DNA에 있는 작은 "상처"의 창조에 의지합니다. 이러한 방식으로 과학자들은 고전적인 유전자 타겟팅에 비해 더 큰 효율을 가진 표적 서열에서 돌연변이를 유도할 수 있습니다.

이 비디오에서는 세 가지 게놈 편집 기술의 원리를 검토하고 그 중 하나인 CRISPR-Cas9 시스템에 대한 일반화된 프로토콜에 대해 논의할 것입니다. 그런 다음 이러한 메서드의 일부 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.

먼저 게놈 편집의 원리를 살펴보겠습니다.

게놈내의 특정 서열에 대한 유전적 변화를 도입하기 위한 고전적인 방법은 상동성 재조합에 의한 유전자 표적화이며, 여기서 상동성 서열을 표적 구조로 통합하면 변경된 버전에 대한 내인성 유전자의 "전환"으로 이어집니다.

유전자 표적화 같이, 게놈 편집은 특정 DNA 지구에 변경을 표적으로 할 수 있습니다, 그러나 어떤 주어진된 실험에 있는 더 많은 세포에 있는 원하는 돌연변이를 확립하는 훨씬 더 높은 효율성으로 이렇게 할 수 있습니다.

모든 게놈 편집 방법은 엔토나셀리스에 의해 DNA에 만든 이중 가닥 휴식을 복구하는 세포의 능력에 의존합니다. 이 손상은 비동종 결합 또는 NHEJ에 의해 복구될 수 있습니다, 여기서 깨진 DNA 끝은 직접 재밀봉됩니다; 또는 상동성 템플릿에서 복사하여 손상이 해결되는 homology 지향 수리 또는 HDR에 의해. NHEJ는 일반적으로 완벽하지 않으며, 여러 기지가 삭제되거나 수리된 DNA에 추가되어 표적 서열을 변질시킬 수 있습니다. 반면, HDR을 사용하면 연구원이 템플릿에 추가하여 대상 사이트에 특정 변경 내용을 전달할 수 있습니다.

3개의 중요한 게놈 편집 기술은 지난 몇 년 동안 개발되고 대중화되었습니다.

한 가지 방법으로, 연구원은 FokI endonuclease의 DNA c떠나는 도메인에 특정 전사 요인의 DNA 결합 "아연 손가락" 도메인을 융합합니다. 각 아연 핑거 도메인이 특정 뉴클레오티드 삼중을 인식함에 따라, 이러한 도메인은 고유 DNA 서열을 표적으로 하는 아연 손가락 뉴클레아제 또는 ZFN을 설계하기 위해 인위적으로 함께 연결될 수 있다.

유사하게, "TALENs"에게 불린 핵은 전사 활성화기 같이 이펙터, 또는 TALEs에게 불린 세균성 단백질의 가변 DNA 결합 도메인에 FokI를 결합합니다. 각 TALE 도메인은 하나의 독특한 DNA 베이스를 인식하여 TALEN에게 서열 특이성을 부여합니다.

마지막으로 CRISPR-Cas9 시스템은 일반적으로 바이러스 나 플라스미드와 같은 외국 유전 물질에 의한 침입으로부터 호스트를 보호하는 원핵 면역 계통의 구성 요소를 사용합니다. 이 시스템에서는 "프로토스페이서"라고 불리는 외국 DNA를 침입하는 조각이 CRISPR 궤적으로 통합되어 단백질 RNA 기계에 의해 crRNA라고 불리는 작은 RNA로 전사되고 처리됩니다.

과학자들은 포유류 세포 또는 기타 관심 계통에 대해 Cas9를 대상으로 하는 데 사용할 수 있는 "단일 가이드" 또는 sgRNA로 알려진 crRNA와 같은 가이드 서열을 설계하여 게놈 편집 목적으로 CRISPR 기계를 활용하고 있습니다. RNA 서열 기반 CRISPR-Cas9 시스템의 간단한 사용자 정의 능력은 ZFN 및 TALEN과 같은 단백질 기반 게놈 편집 방법에 비해 뚜렷한 이점을 제공합니다.

이제 게놈 편집의 원리에 대해 배웠으니 CRISPR을 사용하여 포유류 세포에 있는 표적 유전 적 변화를 만드는 전형적인 프로토콜을 검토해 봅시다.

첫째, 편집할 게놈 위치가 선택됩니다. 이 지역은 크기가 약 20개의 기본 쌍이어야 하며 3) 끝에 3베이스페어 롱 "프로토스페이스 커인즈니티어 모티프" 또는 "PAM"을 보유해야 합니다. PAM은 Cas9이 표적 DNA 영역을 인식하고 갈라야 하며 정확한 서열은 사용되는 Cas9의 기원 생물에 특이적이다. 일단 잠재적인 사이트가 확인되면, 유사한 사이트가 게놈의 다른 곳에서 발견되지 않도록 게놈 서열에 대하여 검색되어야 하고, 따라서 오프 표적 게놈 지구는 편집되지 않습니다.

CRISPR 가이드 서열을 합성하기 위해, 두 개의 올리고뉴클레오티드가 생성되고, 하나는 동일한 하나이며, 하나는 표적 서열에 상보적이다. 추가 시퀀스는 sgRNA 벡터와의 호환성을 위해 5′ 끝에 포함됩니다. 이 올리고뉴클레오티드는 다음 함께 혼합, 변성, 다음 안장.

다음으로, sgRNA "스캐폴드"를 함유하는 플라스미드는 적절한 제한 효소로 절단되고, 합성된 CRISPR 가이드 서열과 혼합하고, 리그아제 효소로 배양하여 sgRNA 구조를 생성한다. 플라스미드는 박테리아로 변형되고 증폭을 위해 배양될 수 있습니다. 일단 박테리아에서 정제되면, CRISPR 구조는 그 게놈이 편집될 세포로 Cas9를 코딩하는 구조와 공동 으로 감염됩니다. 이 전감염된 세포는 클로날 식민지를 형성하기 위하여 배양됩니다.

유전체 DNA는 각 식민지로부터 분리되고 PCR 또는 시퀀싱에 의해 분석되어 CRISPR 시스템이 원하는 돌연변이를 생성한 사람들을 선별할 수 있다.

이제 과학자들이 게놈 편집 기술을 사용하는 몇 가지 방법을 살펴보겠습니다.

많은 연구자들은 게놈 편집을 사용하여 기자 서열을 특정 loci로 소개합니다. 이 실험에서 ZFNs는 뉴런 개발 및 생존에 관여하는 유전자에 녹색 형광 단백질을 삽입하는 데 사용되었습니다. 연구원은 그(것)들이 정확하게 신경으로 분화하기 위하여 줄기 세포를 지시하고, GFP와 신경 마커를 위한 이중 면역 형광을 능력을 발휘해서 이 유전자를 표적으로 했다는 것을 확인했습니다.

게놈 편집은 또한 관심있는 유전자가 비 기능적으로 렌더링되는 "녹아웃"유기체를 생성하는 것이 훨씬 쉬워졌습니다. 여기에서, 연구원은 특정 유전자를 표적으로 하는 mRNA 인코딩 TALENs를 가진 태아를 주입해서 녹아웃 마우스를 만들기 위하여 노력했습니다. TALEN 처리된 마우스에게서 DNA의 후속 종말 처리는 연구원이 표적으로 한 유전자의 두 사본에 있는 돌연변이를 가진 동물을 확인하는 것을 허용했습니다.

마지막으로, 게놈 편집은 동일한 염색체 영역에서 두 개의 이중 가닥 나누기를 유발하여 큰 유전 적 삭제를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 큰 삭제는 유전자 또는 유전 요소의 기능이 전통적인 게놈 편집 프로토콜로 생성된 작은 삭제에 의해 기절될 수 없을 때 필요할 지도 모릅니다. 여기서, 연구원은 GFP 구조와 2개의 CRISPR 구조물을 가진 마우스 암세포를 공동 전기화하고 암 구동 유전자 내의 다른 지역을 표적으로 하는 2개의 CRISPR 구조물. GFP 신호를 이렇게 방출하는 성공적으로 전염된 세포는 형광 활성화 세포 분류에 의해 격리되었고, 후속 PCR 및 시퀀싱 확인된 세포는 두 CRISPR 표적 사이트 사이의 DNA 영역이 삭제되었다.

당신은 게놈 편집에 JoVE의 비디오를 보았다. 여기에서, 우리는 ZFN, TALENs 및 CRISPR의 뒤에 원리를 검토하고, 일반적인 CRISPR-Cas9 프로토콜을 탐구하고, 연구원이 게놈 편집 기술을 오늘 어떻게 사용하는지 토론했습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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