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Overview

Uma técnica bem estabelecida para modificar sequências específicas no genoma é o direcionamento genético por recombinação hologiosa, mas este método pode ser trabalhoso e só funciona em certos organismos. Avanços recentes levaram ao desenvolvimento da "edição de genomas", que funciona induzindo quebras de duas vertentes no DNA usando enzimas nuclease projetadas guiadas para locais genômicos alvo por proteínas ou RNAs que reconhecem sequências específicas. Quando uma célula tenta reparar esse dano, mutações podem ser introduzidas na região de DNA alvo.

Neste vídeo, o JoVE explica os princípios por trás da edição do genoma, enfatizando como essa técnica se relaciona com mecanismos de reparação de DNA. Em seguida, três grandes métodos de edição de genomas - núcleos de dedo de zinco, TALENs e o sistema CRISPR-Cas9 - são revisados, seguidos de um protocolo para o uso do CRISPR para criar alterações genéticas direcionadas nas células mamíferas. Finalmente, discutimos algumas pesquisas atuais que aplicam a edição de genomas para alterar o material genético em organismos modelo ou células cultivadas.

Procedure

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A edição de genomas compreende técnicas com as quais os pesquisadores podem "editar" ou alterar uma sequência específica de DNA. Esses métodos dependem da criação de pequenos "cortes" no DNA, que as células tentam reparar, muitas vezes incompletamente. Dessa forma, os cientistas podem induzir mutações em sequências direcionadas com maior eficiência em comparação com o direcionamento genético clássico.

Neste vídeo, revisaremos os princípios por trás de três técnicas de edição de genomas e discutiremos um protocolo generalizado para um deles, o sistema CRISPR-Cas9. Em seguida, exploraremos algumas aplicações desses métodos.

Primeiro, vamos olhar para os princípios por trás da edição de genomas.

O método clássico para introduzir alterações genéticas em sequências específicas no genoma é o direcionamento genético por recombinação hologous, onde a incorporação de sequências homólogas na construção de alvo leva à "troca" do gene endógeno para uma versão alterada.

Como o direcionamento genético, a edição de genomas pode direcionar mudanças para regiões específicas de DNA, mas pode fazê-lo com muito mais eficiência, estabelecendo as mutações desejadas em mais células em qualquer experimento.

Todos os métodos de edição de genomas dependem da capacidade de uma célula de reparar quebras de dois fios feitas em seu DNA por endonucleases. Este dano pode ser reparado por junção final nonhomologous ou NHEJ, onde extremidades de DNA quebradas são resseladas diretamente; ou por reparo direcionado à e homologia ou HDR, onde o dano é corrigido copiando de um modelo homólogo. NHEJ geralmente não é perfeito, e pode resultar em várias bases sendo excluídas ou adicionadas ao DNA reparado, mutando assim a sequência de alvos. Por outro lado, o HDR permite que os pesquisadores adicionem um modelo para direcionar alterações específicas ao site de destino.

Três grandes técnicas de edição de genomas foram desenvolvidas e popularizadas nos últimos anos.

Em um método, os pesquisadores fundem domínios de "dedo de zinco" de certos fatores de transcrição ao domínio de cobertura de DNA da endonuclease FokI. Como cada domínio de dedo de zinco reconhece um trigêmeo nucleotídeo específico, esses domínios podem ser artificialmente ligados a núcleos de dedos de zinco, ou ZFNs, que visam sequências de DNA únicas.

Da mesma forma, núcleos chamados "TALENs" unem-seao Fok I para os domínios variáveis de vinculação de DNA de proteínas bacterianas chamados efeitores ativadores de transcrição, ou TALEs. Cada domínio TALE reconhece uma base de DNA única e única, dando aos TALENs sua especificidade de sequência.

Finalmente, o sistema CRISPR-Cas9 usa componentes de um sistema imunológico procariótico que normalmente protege seu hospedeiro contra incursão por materiais genéticos estranhos, como aqueles em vírus ou plasmídeos. Neste sistema, pedaços de DNA estrangeiro invasor chamado "protoespaçors" são incorporados em um lócus CRISPR, que é então transcrito e processado por máquinas de proteína-RNA em pequenas RNAs chamadas crRNAs.

Os cientistas estão aproveitando o maquinário CRISPR para fins de edição genômica, projetando sequências guia semelhantes a crRNA conhecidas como "guia único" ou sgRNA, que podem ser usadas para atingir Cas9 para quase qualquer sequência genética desejada em células de mamíferos, ou outros sistemas de interesse. A simples personalização do sistema CRISPR-Cas9 baseado em sequência de RNA fornece vantagens distintas sobre métodos de edição de genomas baseados em proteínas, como ZFNs e TALENs.

Agora que você aprendeu sobre os princípios por trás da edição de genomas, vamos rever um protocolo típico de usar o CRISPR para criar mudanças genéticas direcionadas nas células de mamíferos.

Primeiro, um local genômico a ser editado é escolhido. Esta região deve ser curta — aproximadamente 20 pares de base em tamanho — e possuir um motivo de 3 bases "protoespaço adjacente" ou "PAM" em seu final de 3′. O PAM é necessário para que cas9 reconheça e aperte a região de DNA alvo, e a sequência exata é específica para o organismo de origem do Cas9 que está sendo usado. Uma vez identificado um local em potencial, ele deve ser pesquisado contra a sequência de genomas para garantir que locais semelhantes não sejam encontrados em outros lugares do genoma e, portanto, nenhuma região genômica fora do alvo será editada.

Para sintetizar a sequência guia CRISPR, são gerados dois oligonucleotídeos, um idêntico e outro complementar à sequência de destino. Sequências extras estão incluídas em suas extremidades de 5′ para compatibilidade com os vetores sgRNA. Estes oligonucleotídeos são então misturados, desnaturados, e, em seguida, entubados.

Em seguida, um plasmídeo contendo um "andaime" sgRNA é cortado com a enzima de restrição apropriada, misturado com a sequência de guia CRISPR sintetizada, e incubado com enzima ligase para criar a construção sgRNA. O plasmídeo pode então ser transformado em bactéria e cultivado para amplificação. Uma vez purificada a partir de bactérias, a construção CRISPR é co-transfeinada com uma construção codificando Cas9 nas células cujo genoma deve ser editado. Essas células transfeinadas são cultivadas para formar colônias clonais.

O DNA genômico pode ser isolado de cada colônia e analisado por PCR ou sequenciamento para tela para aqueles em que o sistema CRISPR produziu as mutações desejadas.

Vamos agora olhar para algumas maneiras que os cientistas estão usando técnicas de edição de genomas.

Muitos pesquisadores usam a edição de genomas para introduzir sequências de repórteres em loci específico. Neste experimento, as ZFNs foram utilizadas para inserir proteína fluorescente verde em um gene que está envolvido no desenvolvimento e sobrevivência dos neurônios. Os pesquisadores confirmaram que eles visavam corretamente esse gene direcionando células-tronco para se diferenciar em neurônios, e realizando dupla imunofluorescência para GFP e marcadores neuronais.

A edição de genomas também tornou muito mais fácil gerar organismos "nocauteados", nos quais um gene de interesse é tornado não funcional. Aqui, os pesquisadores procuraram criar camundongos eliminatórios injetando embriões com TALENs de codificação de mRNA que visam genes específicos. O tratamento subsequente de endonuclease de DNA de camundongos tratados com TALEN permitiu que os pesquisadores identificassem animais com mutações em ambas as cópias do gene alvo.

Finalmente, a edição de genomas pode ser usada para criar grandes exclusões genéticas, causando duas quebras de dois fios na mesma região cromossômica. Essas grandes exclusões podem ser necessárias quando a função de um gene ou elemento genético não pode ser eliminada pelas pequenas exclusões criadas com protocolos convencionais de edição de genomas. Aqui, pesquisadores co-eletroporaram células cancerígenas de camundongos com uma construção GFP e dois construtos CRISPR visando diferentes áreas dentro de um gene que conduz o câncer. As células que foram transfectadas com sucesso, que assim emitiriam sinal GFP, foram isoladas pela triagem celular ativada pela fluorescência, e células identificadas subsequentes de PCR e sequenciamento nas quais a região de DNA entre os dois locais alvos do CRISPR foi excluída.

Você acabou de assistir o vídeo do JoVE sobre edição de genomas. Aqui, revisamos os princípios por trás das ZFNs, TALENs e CRISPR, exploramos um protocolo crispr-cas9 geral e discutimos como os pesquisadores estão usando técnicas de edição de genomas hoje. Como sempre, obrigado por assistir!

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