Separazione di miscele tramite precipitazione

Un certo numero di parametri può essere utilizzato per separare un campione di interesse dalle impurità riducendone la solubilità e rimuovendolo da una soluzione come solido, come mostrato nella Figura 1.  In primo luogo, la modifica della forza ionica della soluzione può modificare la solubilità di una sostanza.  Ciò comporta spesso l'aggiunta di sale extra (chiamato anche salatura), o l'aggiunta di un controione, che forma una specie meno solubile con il composto di interesse. ²

Figura 1. Gli equilibri di solubilità sono influenzati dalla forza ionica, dal pH e dalla temperatura. Un composto di interesse (giallo) viene separato dalle impurità (rosso) modificando la sua solubilità in un dato solvente.

La modifica del pH di una soluzione può modificare la carica netta del composto. Ad un certo pH, la carica netta diventa zero (chiamata anche punto isoelettrico) e il composto diventa meno solubile in acqua, formando infine un solido. La temperatura influisce anche sulla solubilità, poiché una temperatura più elevata aumenta la solubilità dei solidi.

Il tasso di formazione dei solidi determina la purezza relativa (Figura 2). In generale, il termine precipitazione si riferisce alla formazione di un solido ad un ritmo rapido, producendo così un campione amorfo con alcune impurità intrappolate all'interno. Questo è comune nei processi di salatura e di modifica del pH. Quando questo processo viene rallentato, le impurità non vengono intrappolate all'interno del composto e viene prodotto un solido relativamente puro. Questa tecnica è impiegata nella ricristallizzazione. In questo processo, un composto viene disciolto in un solvente sufficiente per essere solo nel punto di saturazione a una temperatura elevata. Questa soluzione satura viene quindi lasciata raffreddare lentamente. Man mano che la soluzione si raffredda, la solubilità del componente diminuisce e il composto in eccesso rispetto alla solubilità forma un solido ben ordinato (altrimenti noto come cristalli) invece di un solido amorfo. Le impurità nella soluzione non rimangono intrappolate poiché il processo lento consente la rimozione di queste impurità sulla superficie del solido prima che vengano intrappolate. ¹

Figura 2. Differenza tra precipitazioni e ricristallizzazione.

Una volta che il solido si è formato (sia come cristallo che come precipitato), dovrebbe essere separato dal resto della miscela. La filtrazione è un modo per separarli. Questo impiega un materiale poroso che inibisce selettivamente il passaggio del materiale solido ma non della soluzione.

La centrifugazione è un altro modo per separare il precipitato dal resto della miscela. La centrifugazione utilizza l'accelerazione centripeta per separare le miscele in base alle loro densità. Poiché il solido è più denso della soluzione acquosa, i sedimenti solidi sul fondo del contenitore. Il solido è anche chiamato il pellet e la soluzione acquosa, il surnatante. Il surnatante può quindi essere travasato o estratto utilizzando un pipetto o una siringa. I cristalli sono fragili e la centrifugazione spesso non viene utilizzata per separarli dalla soluzione.

Questo video coprirà diversi metodi di separazione dei composti attraverso la formazione di solidi (salatura, variazioni di pH e ricristallizzazione) e la loro successiva rimozione dalla soluzione acquosa attraverso la filtrazione o la centrifugazione.

1. Precipitazione di CaCO₃

1. Preparare 5 ml di 1 M CaCl₂.
2. Preparare 5 mL 1 M Na₂CO₃.
3. In un piccolo tubo centrifugo (1,5 mL), aggiungere 750 μL di CaCl₂ e 750 μL di Na₂CO₃.
4. Attendere 2 minuti affinché si verifichi la reazione. La soluzione dovrebbe diventare torbia.
5. Centrifugare la miscela a 10.000 × g per 5 min.
6. Decantare il surnatante.
7. Aggiungere 1 mL di acqua fredda al pellet.
8. Risuspendare il pellet mescolando in un miscelatore a vortice per 10 s.
9. Centrifugare la miscela a 10.000 × g per 5 min.
10. Decantare il surnatante.

2. Precipitazione delle proteine del latte

1. Versare il latte in un becher e aggiungere una barra di agitazione.
2. Scaldare delicatamente il latte fino a 40 °C in una piastra calda mescolando. Non riscaldare oltre i 40 °C.
3. Preparare un 15% (v/v) di acido acetico mescolando 7,5 ml di acido acetico e diluendo in acqua sufficiente per raggiungere i 50 ml.
4. Immergere l'elettrodo di un pHmetro nel latte caldo e monitorare il pH.
5. Aggiungere l'acido acetico goccia al latte fino a raggiungere un pH di 4,6.
6. Filtrazione del latte
   1. Scanalare un pezzo di carta da filtro e metterlo in un imbuto.
   2. Posizionare l'imbuto in un pallone e versare la soluzione di latte acidificata nell'imbuto.
   3. Quando la soluzione viene versata, la carta da filtro potrebbe intasarsi. Usando un'asta di agitazione, agitare la soluzione e la carta da filtro di tanto in tanto per sbloccare. Se non migliora il passaggio della soluzione, cambiare la carta da filtro.
   4. Posizionare una nuova carta da filtro sul piano di lavoro e trasferire la maggior parte del solido bagnato nella nuova carta da filtro. Questo dovrebbe assorbire più acqua dal solido.
   5. Se la nuova carta da filtro si bagna troppo, continuare a cambiarla fino a quando non c'è una quantità minima di umidità sulla carta da filtro. Premerlo leggermente per assorbire più acqua, se necessario.
   6. Prendere il solido essiccato e ri-sospendere in circa il 70% di etanolo. Filtrare nuovamente il solido seguendo i passaggi da 2.6.1 a 2.6.5.
7. Centrifugazione del latte (in alternativa alla filtrazione)
   1. Trasferire porzioni da 50 mL della miscela in tubi centrifughi da 50 mL.
   2. Centrifugare a 4.500 × g per 10 min, quindi decantare il surnatante.
   3. Aggiungere 50 ml di etanolo al 70% al pellet.
   4. Utilizzando un'asta di agitazione, risusediare il pellet nell'etanolo.
   5. Centrifugare questa sospensione seguendo il punto 2.7.2.
8. Risuspenare il pellet in tampone per ulteriori analisi come SDS-PAGE, altrimenti conservarlo a 4°C.

3. Ricristallizzazione di KCl

1. Pesare 50 g di KCl in un matraccio Erlenmeyer e aggiungere 100 ml di acqua
2. Riscaldare la miscela fino a quando l'acqua bolle. Assicurarsi che tutta la polvere di KCl sia sciolta. Alcune impurità potrebbero non dissolversi in acqua.
3. Scaldare un altro matraccio Erlenmeyer (vuoto) insieme al composto e tenerlo molto caldo.
4. Mettere un imbuto con carta da filtro nel pallone caldo e vuoto.
5. Versare la soluzione attraverso la carta da filtro per rimuovere le impurità non disciolte. Il pallone ricevente viene mantenuto caldo per assicurarsi che non si verifichino variazioni di temperatura durante la filtrazione, altrimenti si formerà un precipitato grezzo. Se ciò accade, riscaldare nuovamente la miscela fino a quando tutto il precipitato si dissolve.
6. Togliere il matraccio con la soluzione dal fuoco.
7. Tenerlo in un luogo fresco nella stanza e lasciarlo raffreddare lentamente per circa 30 minuti, o fino a quando non è più caldo al tatto.
8. Una volta raffreddato a temperatura ambiente, mettere il pallone in un bagno di ghiaccio per abbassare ulteriormente la temperatura. In alternativa, si può lasciare il pallone all'interno del frigorifero o in un locale a temperatura controllata a 4 °C.
9. I cristalli possono essere raccolti filtrando come nei passaggi 3.4-3.5 (utilizzare un pallone e un imbuto a temperatura ambiente).

Gli equilibri di solubilità sono impiegati in molti processi di purificazione.  Il calcio può essere rimosso dall'acqua usando carbonato di sodio. Il prodotto di solubilità (K_sp) di CaCO₃ è 4,8 × 10^-9. Miscelando 1 M di CaCl₂ e 1 M di Na₂CO₃ ha prodotto un precipitato CaCO_3. Il precipitato è stato separato dal resto della soluzione utilizzando la centrifugazione.

La caseina (una proteina chiave nel latte) ha un punto isoelettrico a pH 4,6 e forma cagliata insolubile a questo pH. La cagliata è stata quindi separata dal resto della soluzione (chiamata anche siero di latte) utilizzando la filtrazione o la centrifugazione (Figura 3a). La cagliata è stata lavata con etanolo per rimuovere fosfolipidi e altri composti solubili in acqua che erano anche intrappolati nella cagliata. La centrifugazione ha impedito la perdita di proteine meglio della filtrazione in quanto c'erano alcune proteine che si attaccavano alla carta da filtro. I componenti separati sono stati analizzati utilizzando SDS-PAGE (Figura 3b), mostrando che la reazione di precipitazione ha separato la maggior parte della caseina dal siero di latte. Altre proteine del latte, come le globuline, precipitano insieme alla caseina. Ulteriori misure possono essere applicate per isolare la caseina dal resto delle proteine.

La precipitazione rimuove la maggior parte delle impurità dal solido, tuttavia può anche intrappolare alcune impurità all'interno della matrice. La ricristallizzazione è spesso impiegata per purificare ulteriormente un solido (Figura 4). In questo esperimento, il solido è stato miscelato con un solvente in cui il solido non era molto solubile. La temperatura della miscela è stata quindi elevata al punto di ebollizione del solvente e viene aggiunto abbastanza solido per saturare il solvente caldo. Altre impurità insolubili potrebbero quindi essere rimosse tramite una fase di filtrazione. La soluzione calda è stata quindi gradualmente raffreddata a temperatura ambiente e ulteriormente raffreddata in frigorifero/cella frigorifera/bagno di ghiaccio. Il lento processo ha portato a cristalli invece di precipitato amorfo. Le impurità solubili non erano incorporate nel reticolo cristallino e i cristalli risultanti erano relativamente più puri del precipitato grezzo. I cristalli sono stati poi raccolti mediante filtrazione e lasciati asciugare all'aria (o sottovuoto).

Figura 3. Precipitazione delle proteine del latte. (A) Immagini delle diverse fasi dell'isolamento delle proteine del latte. (B) SDS-PAGE dei diversi campioni.

Figura 4. Ricristallizzazione di KCl.

Le reazioni di precipitazione vengono applicate a molti processi di preparazione dei campioni. Come accennato in precedenza, possono essere utilizzati per rimuovere sali o ioni specifici a seconda dei loro equilibri di solubilità. Possono anche essere usati per rimuovere proteine e altre biomolecole dalle miscele.

La ricristallizzazione viene spesso utilizzata per purificare ulteriormente i solidi. Questo processo rimuove le impurità intrappolate all'interno del solido. Tra gli altri, la ricristallizzazione può essere utilizzata per purificare sali e molecole organiche.

Le tecniche di centrifugazione e filtrazione sono applicabili alla maggior parte delle richieste di preparazione dei campioni per separare i componenti insolubili dal solvente. La filtrazione è spesso utilizzata in chimica organica per separare i composti cristallizzati puri dal suo solvente. Viene anche utilizzato dopo estrazioni solido-liquido nella chimica dei prodotti naturali o nella chimica analitica. La centrifugazione viene spesso utilizzata per separare miscele di diverse densità e, come mostrato qui, applicata alla separazione dei componenti del latte e del sale precipitato.

In biochimica, la maggior parte dei processi come l'isolamento di proteine, lipidi e DNA comporta reazioni di precipitazione, centrifugazione e metodi di filtrazione per purificare i campioni. E mentre la maggior parte di questi processi sono stati completamente standardizzati in kit commerciali, c'è ancora molto spazio per l'ottimizzazione, poiché diverse molecole biologiche richiedono condizioni diverse.