Trennen von Gemischen durch Ausfällung

Eine Reihe von Parametern kann verwendet werden, um eine Probe von Interesse von Verunreinigungen zu trennen durch Reduzierung seiner Löslichkeit und Herausnahme aus einer Lösung als Feststoff, wie in Abbildung 1dargestellt.  Erstens können die Ionenstärke der Lösung eine Löslichkeit von Stoffen ändern.  Dazu gehört oft die Zugabe von zusätzlichen Salz (auch genannt Salzen) oder die Zugabe von einem Counter Ion, bildet eine weniger löslichen Arten mit der Verbindung von Interesse. ²

Abbildung 1: Löslichkeit Gleichgewichte von Ionenstärke, pH-Wert und Temperatur betroffen sind. Eine Verbindung von Interesse (gelb) trennt sich von Verunreinigungen (rot) durch eine Änderung seiner Löslichkeit in einem bestimmten Lösungsmittel.

Den pH-Wert einer Lösung kann das der Nettoladung der Verbindung ändern. Bei einem bestimmten pH-Wert der Nettoladung Null (auch genannt isoelektrischen Punkt) und die Verbindung wird weniger löslich in Wasser, schließlich bildet eine solide. Die Temperatur beeinflusst auch Löslichkeit, da höherer Temperatur erhöht die Löslichkeit von Feststoffen.

Die Rate der soliden Ausbildung bestimmt relativen Reinheit (Abbildung 2). Im Allgemeinen der Begriff Niederschlag bezieht sich auf die Bildung eines festen in einem rasanten Tempo, wodurch eine amorphe Probe mit einige Verunreinigungen innerhalb gefangen. Dies ist häufig bei Salzen und pH-Wert bedingte Prozesse. Wenn dieser Prozess verlangsamt wird, die Verunreinigungen auf dem Gelände nicht gefangen sind und festem Untergrund relativ reines entsteht. Diese Technik wird in Rekristallisation eingesetzt. In diesem Prozess wird eine Verbindung in genügend Lösungsmittel nur bei dem Sättigungspunkt bei erhöhter Temperatur zu aufgelöst. Das gesättigte Lösung darf dann langsam abkühlen lassen. Die Lösung kühlt, verringert sich die Löslichkeit der Komponente sowie die Verbindung über die Löslichkeit bildet eine wohlgeordnete solide (auch bekannt als Kristalle) anstelle einer amorphen Festkörper. Verunreinigungen in der Lösung nicht verfangen, wie der langsame Prozess ermöglicht die Beseitigung dieser Verunreinigungen an der Oberfläche des Festkörpers, bevor sie gefangen sind. ¹

Abbildung 2. Differenz zwischen Niederschlag und Rekristallisation.

Sobald der Feststoff (ob als Kristall oder als einen Niederschlag) gebildet hat, sollte es vom Rest der Mischung getrennt werden. Die Filtration ist ein Weg, um sie zu trennen. Dies setzt ein poröses Material, das selektiv den Durchgang von der Feststoff, aber nicht die Lösung hemmt.

Zentrifugation ist eine weitere Möglichkeit, den Niederschlag vom Rest der Mischung zu trennen. Zentrifugation verwendet zentripetale Beschleunigung zum Trennen von Mischungen anhand ihrer Dichte. Seit Solid ist Dichter als die wässrige Lösung, die festen Ablagerungen an der Unterseite des Behälters. Das Solid nennt man auch die Pellets und die wässrige Lösung, der Überstand. Der Überstand kann dann dekantiert oder mit einer Pipettieren oder Spritze abgesaugt. Kristalle sind zerbrechlich und Zentrifugation wird oft nicht eingesetzt, um sie aus der Lösung zu trennen.

Dieses Video werden verschiedene Methoden der Trennung von Verbindungen durch solide Bildung (Salzen, pH-Wert-Änderungen und Rekristallisation) und ihre anschließende Entfernung aus der wässrigen Lösung durch Filtration oder Zentrifugation abdecken.

1. die Ausfällung von CaCO₃

1. 5 mL 1 M CaCl₂vorbereiten.
2. 5 mL 1 M Na₂CO₃vorbereiten.
3. Dazugeben Sie in einem kleinen Zentrifugenröhrchen (1,5 mL) 750 µL CaCl₂ 750 µL Na₂CO₃.
4. Warten Sie 2 Minuten für die Reaktion auftreten. Die Lösung sollte bewölkt drehen.
5. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 10.000 × g für 5 min.
6. Den Überstand abgießen.
7. Das Pellet 1 mL kaltes Wasser hinzufügen.
8. Aufschwemmen der Pellets durch das Mischen in einem Vortex-Mixer für 10 s.
9. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 10.000 × g für 5 min.
10. Den Überstand abgießen.

(2) Niederschlag der Milchproteine

1. Gießen Sie die Milch in ein Becherglas und fügen Sie eine Bar unter Rühren hinzu.
2. Warme Milch vorsichtig bis 40 ° C in einer mitreißenden Heizplatte. Nicht über 40 ° c erhitzen
3. Bereiten Sie eine 15 % (V/V) von Essigsäure durch 7,5 mL Essigsäure mischen und verdünnen in genügend Wasser, 50 mL zu erreichen.
4. Tauchen Sie die Elektrode ein pH-Meter in warmer Milch, und überwachen Sie den pH-Wert.
5. Die Essigsäure tropfenweise die Milch fügen Sie bis ein pH-Wert von 4,6 erreicht ist hinzu.
6. Filtration von Milch
   1. Ein Stück Filterpapier Querflöte und legen Sie sie in einen Trichter.
   2. Setzen Sie den Trichter in eine Flasche und die gesäuerte Milch-Gemisch in den Trichter.
   3. Da die Lösung gegossen wird, kann das Filterpapier verstopft. Mit einem Rührstäbchen, Regen Sie die Lösung und Filterpapier gelegentlich auf die Sprünge zu helfen. Wenn es im Laufe der Lösung nicht bessert, ändern Sie das Filterpapier.
   4. Legen Sie ein neues Filterpapier auf die Benchtop und den Transfer so viel Nässe fest, um das neue Filterpapier. Dies sollte mehr Wasseraufnahme aus dem vollen.
   5. Wenn das neue Filterpapier zu nass wird, weiterhin es ändern, bis es minimale Menge von Nässe auf dem Filterpapier gibt. Drücken Sie es leicht, mehr Wasser zu absorbieren, wenn nötig.
   6. Nehmen Sie die getrockneten Feststoff und wieder auszusetzen, in etwa 70 % Ethanol. Filtern Sie die wieder Schritte 2.6.1 auf 2.6.5 Solid.
7. Zentrifugieren der Milch (als Alternative zur Filtration)
   1. Übertragen Sie 50 mL Portionen des Gemisches auf 50 mL Zentrifuge Rohre.
   2. Bei 4.500 × g für 10 min Zentrifugieren Sie und dekantieren Sie des Überstandes.
   3. Das Pellet 50 mL 70 % igem Ethanol hinzufügen.
   4. Mit einem Rührstäbchen, Aufschwemmen der Pellets in das Ethanol.
   5. Zentrifugieren Sie diese Aussetzung nach Schritt 2.7.2.
8. Das Pellet in Puffer für weitere Analysen wie SDS-PAGE Aufschwemmen, ansonsten bei 4 ° c lagern

(3) Rekristallisation des KCl

1. Gewicht von 50 g KCl in einen Erlenmeyerkolben und 100 mL Wasser hinzufügen
2. Erhitzen Sie die Mischung, bis Wasser kocht. Sicherstellen Sie, dass alle KCl Pulver aufgelöst hat. Einige Verunreinigungen dürfen nicht in Wasser auflösen.
3. Erhitzen Sie einen anderen (leeren) Erlenmeyerkolben zusammen mit der Mischung und halten Sie sehr warm.
4. Setzen Sie einen Trichter mit Filterpapier in die warme, leere Flasche.
5. Gießen Sie die Lösung durch das Filterpapier, ungelöste Verunreinigungen zu entfernen. Der Auffangkolben wird warmgehalten, um sicherzustellen, dass keine Temperaturschwankungen während der Filtration, die sonst auftreten, die ein grober Niederschlag bilden wird. In diesem Fall erneut erhitzen Sie die Mischung, bis der Niederschlag löst sich.
6. Nehmen Sie die Flasche mit der Lösung vom Herd.
7. Bewahren Sie es an einem kühlen Ort im Raum und lassen Sie ihn abkühlen langsam für etwa 30 Minuten, oder bis es keine mehr warm an.
8. Sobald auf Raumtemperatur abgekühlt ist, legen Sie die Flasche in ein Eisbad, weiter senken die Temperatur. Alternativ kann man die Flasche in den Kühlschrank oder einem temperierten Raum bei 4 ° c verlassen
9. Kristalle können durch Filtern wie in Schritt 3.4-3.5 geerntet werden (verwenden Sie eine Flasche und Trichter bei Raumtemperatur).

Löslichkeit Gleichgewichte ist in vielen Reinigungsverfahren eingesetzt.  Kalzium kann von Natriumcarbonat mit Wasser entfernt werden. Die Löslichkeit Produkt (K_sp) von CaCO₃ ist 4,8 × 10^-9. Mischen von 1 M von CaCl₂ und 1 M Na₂CO₃ produziert CaCO₃ Niederschlag. Der Niederschlag trennte sich vom Rest der Lösung mittels Zentrifugation.

Kasein (ein wichtiger Protein in der Milch) hat einen isoelektrischen Punkt bei pH 4.6 und unlösliche Klumpen bei diesem pH-Wert gebildet. Der Quark wurden dann von den Rest der Lösung (auch genannt Molke) mit Filtration oder Zentrifugation (Abbildung 3a) getrennt. Der Quark wurde gewaschen, mit Ethanol, Phospholipide und andere wasserlöslichen Verbindungen, die auch gefangen wurden in den Quark zu entfernen. Zentrifugation verhindert Verlust von Proteinen, die besser als Filtration, da gab es einige Proteine, die auf dem Filterpapier stecken. Die getrennten Komponenten wurden mit SDS-PAGE (Abb. 3 b), zeigen, dass die Niederschläge Reaktion die meisten das Kasein von der Molke getrennt analysiert. Anderen Milchproteine, wie z.B. Globuline, überstürzen sich zusammen mit Kasein. Weitere Schritte können angewendet werden, für die Isolierung von Kasein vom Rest der Proteine.

Niederschlag entfernt die meisten Verunreinigungen aus dem vollen, aber es auch einige Verunreinigungen innerhalb der Matrix abfangen kann. Rekristallisation wird oft eingesetzt, um eine solide (Abbildung 4) weiter zu reinigen. In diesem Experiment wurde der Feststoff mit einem Lösungsmittel gemischt in dem festen nicht sehr gut löslich war. Die Temperatur des Gemisches wuchs dann bis zum Siedepunkt des Lösungsmittels und genügend festen wird hinzugefügt, um die heiße Lösungsmittel sättigen. Andere unlöslichen Verunreinigungen könnten dann über eine Filtrationsschritt entfernt werden. Die heiße Lösung wurde dann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt und abgekühlt in einem Kühlschrank und kaltem Zimmer/Eisbad weiter. Der langsame Prozeß führte in Kristallen anstelle von amorphen Niederschlag. Die löslichen Verunreinigungen wurden nicht in das Kristallgitter eingebaut und die daraus resultierenden Kristalle waren relativ mehr rein als der Rohe Niederschlag. Die Kristalle wurden dann mit Filtration und Links zum Trocknen an Luft (oder im Vakuum) geerntet.

Abbildung 3. Ausfällung von Milcheiweiß. (A) Bilder von verschiedenen Schritten Milch Protein isoliert. (B) SDS-PAGE von den verschiedenen Proben.

Abbildung 4. Rekristallisation des KCl.

Niederschlag Reaktionen sind für viele Probe Vorbereitung Prozesse angewendet. Wie bereits erwähnt, können sie verwendet werden, Salze oder bestimmte Ionen je nach ihrer Löslichkeit Gleichgewichte zu entfernen. Sie können auch verwendet werden, um Proteine und andere Biomoleküle aus Mischungen zu entfernen.

Rekristallisation wird oft eingesetzt, um Feststoffe weiter zu reinigen. Dieser Vorgang entfernt eingeschlossene Verunreinigungen innerhalb der Solids. Rekristallisation ist u.a. einsetzbar, Salze und organischen Molekülen zu reinigen.

Zentrifugation und Filtration Techniken gelten für die meisten Probe Vorbereitung Forderungen zu unlöslichen Bestandteile vom Lösungsmittel zu trennen. Filtration wird oft in der organischen Chemie verwendet, um seine Lösungsmittel reinen kristallisierte Verbindungen trennen. Es wird auch nach fest-flüssig-Extraktion in Naturstoffchemie oder analytische Chemie verwendet. Zentrifugation wird häufig verwendet um Mischungen unterschiedlicher Dichte und wie gezeigt zu trennen hier auf Trennung von Milchbestandteilen und niedergeschlagene Salz angewendet.

In Biochemie, beinhaltet die meisten Prozesse wie Protein, Lipid und DNA-Isolierung Niederschlag Reaktionen, Zentrifugieren und filtrieren Methoden, um Proben zu reinigen. Und während die meisten dieser Prozesse vollständig in kommerziellen Kits standardisiert worden, es gibt noch viel Raum für Optimierung, wie verschiedene biologische Moleküle unterschiedliche Bedingungen erfordern.