Medicine
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Av beryllium oppløsning mus Optical Coherence tomografi å hjelpe intraokulært injeksjon i netthinnen genterapi forskning
Chapters
Summary November 2nd, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her viser vi en ny tilnærming til å bruke høy oppløsning spectral domener optical coherence tomografi (HR-SD-oktober) å hjelpe levering av gene terapi agenter i subretinal plass, vurdere dekningen areal og karakteriserer photoreceptor vitalitet.
Transcript
Det overordnede målet med denne subretinale injeksjonsprosedyren er å levere en vektor til netthinnen på en minimal invasiv og reproduserbar måte som kan observeres i sanntid. Hei, denne metoden kan brukes til å svare på viktige spørsmål i genterapi forskning om vektor levering effekt og terapeutiskmiddel toksisitet. Noen fordeler med denne teknikken inkluderer minimal skade på netthinnen og andre øyestrukturer, presis kartlegging på injeksjonsstedet og strenge kvantitative in vivomålinger som tillater solid statistisk slutning.
For intraokulær transgeninjeksjon, plasser først en bedøvet mus på visningsstadiet av et retinal bildesystemmikroskop og plasser tuppene av en steril, stump iris tang på syv og 10 o'clock posisjoner av øyelokket mens du skyver tang åpne og ned for å forsiktig indusere proptose. Bruk tangen til å koaksial øyelokkene under øyekloden og rett spissen av nålen til omtrent en til 1,5 millimeter under kanten av hornhinnen limbus. Deretter påfør en dråpe steril PBS-løsning på øyet og dekk øyet med en steril dekselslip.
Kjør nålen forsiktig inn i øyet gjennom conjunctiva til en skleral depresjon er opprettet. Bruk mikromanipulatoren til å rotere øyet oppover til den skleraldepresjonen er i fokus, og kjør deretter nålen fremover for å skape en skarp topp i netthinnen med spissen av nålen. Bruk nåleholderen til å rotere nålen bare til spissen av nåleborene gjennom sclera og RPE, slik at melescein i spissen av nålen kan være synlig under netthinnen vev i umiddelbar nærhet av subretinal plass og retinal pigment epitel celle monolayer.
Kjør tuppen av nålen nedover slik at den er tangential til kloden, og aktiver deretter injeksjonspumpen med fotpedalbryteren. Etter at 0,5 til én mikroliter transgeneoppløsning er levert til subretinalrommet, trekk nålen tilbake og bekreft at blodet er stabilt og at væsken ikke lekker ut av injeksjonsstedet. For å bekrefte injeksjonens suksess, registrer et rektangulært volum OCT og sammenlign bildene med bilder av de ulike typer potensielle injeksjonsresultater.
Etter bekreftelse av riktig injeksjon plassering, bruk det rektangulære OCT bildet for å kartlegge omfanget av bleb på fundus bildet. For å kartlegge omfanget av subretinal bleb, åpne et rektangulært volum OCT bilde av bleb slik at et gjenkjennelig landemerke i øyet er inkludert i bildet. Legg til så mange kalipere som nødvendig for å identifisere posisjonen til venstre og høyre kant av B-skanningen, samt synsnervehodet, ONH, hvis det finnes, og bøyningspunktet der netthinnen løsner fra RPE og choroid og deretter lagre dataene.
Deretter kompilere de lagrede filene og plotte dataene, effektivt lage et kart over injeksjon bleb på en ansikt OCT bilde. Overlegg de plottede dataene på fundusbildet som inneholder injeksjonsstedet og lagre det sammenslåtte bildet. Bruk dette bildet til å finne områder av interesse under oppfølging oct imaging.
For å vurdere netthinnedegenerasjon etter injeksjon, må du først åpne et registrert spektraldomene MED høy oppløsning OCT eller HRSD OCT rektangulært volumbilde og velge en B-skanning som skal måles. Forstørre det valgte bildet til det fyller skjermen og høyreklikk på bildet. Klikk kalipere for å velge riktig antall kalipere, og bruk deretter konfigurer kaliperfunksjonen til å tilordne kaliperne som vertikale i vinkelblokkkolonnen og slå på skjermkaliberplasseringen for å forenkle ensartet kaliperplassering over netthinnen.
Klikk påfør og flytt hver kaliper til riktig sted 0,1 til 0,2 millimeter fra hverandre over B-skanningen, og ta vare på å plassere en kaliper i midten av synsnervehodet når det er hensiktsmessig. Når alle kaliperne er plassert, klikker og drar du hvert kaliper til lengden på interesseområdet, og setter vilkårlig kalipere som ikke overlegger målbare områder av B-skanningen til maksimal lengde. For å måle den ytre kjernefysiske lagtykkelsen, plasser toppen av hvert kaliper på den eksterne begrensende membranen og bunnen av hver kaliper nederst på det ytre pleksiformlaget ved 0,1 til 0,2 millimeter trinn over netthinnen.
Etter at alle kaliperne er plassert og justert til størrelse, høyreklikker du på bildet og klikker lagre kaliperdata"og gjentar deretter målingene som bare demonstrert for hver tiende B-skanning, holder kaliperne åpne og på samme sted på x-aksen og justerer lengdene på kaliperne etter behov, uten å flytte dem i x-retningen. Når alle skanningene er målt, åpner du de lagrede datafilene og klikker datoen endret"for å ordne filene i henhold til tid lagret. Åpne alle filene for hver B-skanning som måles, og kompiler rådatane fra hver B-skanning til én enkelt fil fra laveste til høyeste rammenummer, og velg kolonnene med data, inkludert kalipernavn, lengde og midtstilt X-kolonner.
Kontroller at den midtre X er den samme for alle B-skanningene som måles for hvert rektangulært volum OCT-bilde som behandles, og slett data fra kaliperne som ikke ble brukt til å registrere målinger. Sett kaliperen plassert i midten av synsnerven til null og plott dataene for X versus flere Y-datasett for å få en 3D-plottfunksjon for tykkelsen på det ytre kjernefysiske laget eller andre målte retinale lag. Sammenlign deretter de ytre kjernefysiske lagmålingene mellom kontroll og eksperimentelle dyr med tilsvarende aldre for å bestemme hastigheten og ensartetheten til potensiell retinal degenerasjon.
For 3D-kartlegging av retinale målinger, gjennomgå post-injeksjon OCT bilder og merk eventuelle identifiserbare landemerker, deretter plassere dyret for å få en oppfølging SDO CT bilde fra samme region, ta vare på å inkludere de samme identifiserbare landemerker, og behandle de innspilte bildene som nettopp demonstrert. Det er svært viktig å få høy kvalitet OCT bilder som inkluderer identifiserbare landemerker for å lette reimaging av tidligere injisert retinal regioner. For å måle endringene i OS-lengde ble kalipere plassert fra den eksterne begrensende membranen til Brooks-membranen, noe som åpner for pålitelige målinger siden disse lagene lett identifiseres i OCT-bilder.
Forskjeller i målingene mellom disse lagene fra forskjellige muselinjer ble tilskrevet kortere ytre segmentlengder. Hvis subretinal injeksjonen utføres med hell, induserer åpningen av det subretinale rommet produksjonen av en bleb som tydelig kan visualiseres både i en ansiktsvisning av HRSD OCT-bildeleren og i B-skannebildene. Overlaging av grensekartet til injeksjonsstedet tillater segmentering av retinal vevsmålinger og kaliperposisjonsdatasett for å tillate påfølgende statistisk testing av effekten av spesifikke terapeutiske midler på retinal degenerasjon.
Når mestret, kan denne teknikken fullføres i ti minutter hvis den utføres riktig. Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske å holde det kirurgiske miljøet rent og sterilt. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen genterapi for å overvåke hele subretinal kirurgisk injeksjonsprosess i sanntid og skapte en måte å umiddelbart bestemme kirurgisk suksess in vivo.
Etter denne injeksjonsprosedyren kan OCT og andre metoder som elektroretinografi utføres for å svare på flere spørsmål om transgen funksjonell redning og/eller toksisitet. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en forståelse av hvordan du utfører transsklerale og transchoroidale subretinale injeksjoner, hvordan du kartlegger omfanget av injeksjonen bleb på OCT fra dette bildet, og få strenge målinger av de ytre retinale lagene. Ikke glem at det å arbeide med genterapivektorer kan være farlig, og at forholdsregler, for eksempel bruk av riktig personlig verneutstyr, alltid bør brukes mens du utfører denne prosedyren.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
