Overview
מקור: המעבדה של ד"ר ח'ולוד אל-ג'מאל - קינגס קולג' לונדון
ספקטרומטריית מסה היא טכניקה אנליטית בכימיה המאפשרת זיהוי של תרכובות לא ידועות בתוך מדגם, כימות חומרים ידועים, קביעת המבנה ומאפיינים כימיים של מולקולות שונות.
ספקטרומטר מסה מורכב ממקור יינון, מנתח וגלאי. התהליך כרוך יינון של תרכובות כימיות כדי ליצור יונים. בעת שימוש בפלזמה מצמידה אינדוקטיבית (ICP), דגימות המכילות אלמנטים של עניין הם הציגו לתוך פלזמה ארגון כמו טיפות תרסיס. הפלזמה מייבשת את התרסיס, מנתקת את המולקולות, ואז מסירה אלקטרון מהרכיבים כדי להתגלות על ידי ספקטרומטר המסה. שיטות יינון אחרות כגון יינון אלקטרוספראי (ESI) ויינון ירידה בלייזר בסיוע מטריצה (MALDI) משמשות לניתוח דגימות ביולוגיות. לאחר הליך היוניזציה, יונים מופרדים בספקטרומטר המסה בהתאם ליחס המסה-לטעינה שלהם (m/z), והשפע היחסי של כל סוג יונים נמדד. לבסוף, הגלאי מורכב בדרך כלל במכפיל אלקטרונים שבו התנגשות של יונים עם אנודה טעונה מובילה למפל של מספר גדל והולך של אלקטרונים, אשר ניתן לזהות על ידי מעגל חשמלי המחובר למחשב.
בסרטון וידאו זה, ההליך של ניתוח ICP-MS יתואר על ידי זיהוי של 56Fe כדוגמה.
Principles
ICP-MS משלב מקור ICP בטמפרטורה גבוהה (פלזמה משולבת באופן אינדוקטיבי) עם ספקטרומטר מסה.
דגימות צריכות להיות בצורה יונית לפני הזנת מנתח המסה כדי להתגלות. תהליך העיכול של דגימות מוצקות מורכב מדגירה של דגימות מוצקות לחומצה חזקה ומחמצן בטמפרטורה גבוהה ולתקופת זמן ממושכת בהתאם לנתח המתכת. המדגם מוצג כמו תרסיס לתוך פלזמת ICP (טמפרטורה של 6,000-10,000 K) כדי להמיר אטומים גזיים, אשר מיוננים.
מנתח המסה הנפוץ ביותר הוא מסנן המסה של quadrupole. זה עובד כמסנן אלקטרוסטטי המאפשר רק יונים של יחס מסה לטעינה אחת (m/ z) להגיע לגלאי בזמן נתון. זה יכול להפריד עד 15,000 דלטון (Da) לשנייה ולכן נחשב בעל תכונות ניתוח רב אלמנטרי בו זמנית. ICP-MS היא שיטה רגישה מאוד המאפשרת זיהוי של אלמנטים עם ריכוזים מתחת לחלקיקים למיליארד (ppb), ומתחת לחלקיקים לטריליון (ppt) עבור אלמנטים מסוימים.
לבסוף, מערכת הגלאים ממירה את מספר היונים ההולכים את הגלאי לאות חשמלי. באמצעות תקני כיול (דגימות של ריכוז ידוע עבור אלמנט מסוים), ניתן להעריך את הריכוז של מדגם עבור אלמנט אחד או כמה עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. ניקוי צינורות פוליקרבונט
- השתמש בצינורות פוליקרבונט עמידים בפני פתרונות חומציים לעיכול מדגם. על מנת להסיר כל עקבות מזהמים של ברזל, למלא את כל הצינורות עם 5 מ"ל של 0.1 M HCl.
- מניחים צינורות באמבט מים במשך שעה אחת ב 50 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את הצינורות עם 5 מ"ל של מים מילי-Q ולייבש את הצינורות בתנור או מכסה המנוע הכימי.
2. הכנת דגימה ועיכול
- מניחים 200 מיקרול של מדגם ב 1.8 מ"ל של חומצה חנקתית מרוכזת (65%).
- מניחים צינורות באמבט מים למשך הלילה בשעה 50 מעלות צלזיוס. התאם את הפרוטוקול על ידי הגדלת הטמפרטורה אם יש צורך בהפחתה של זמן העיכול הכולל.
- תן לצינורות להתקרר בטמפרטורת החדר.
- לדלל את הדגימות על ידי הוספת 8 מ"ל של מי מילי-Q כדי להשיג ריכוז חומצה חנקתית סופית מפוח 20% (v/ v).
- צינורות צנטריפוגות ב 3,000 x g במשך 10 דקות כדי גלולה כל שאריות מקרוסקופיות הנותרות.
3. הכנת הכלי
- לנקות את לפיד ICP באמצעות ultrasonication ב 5% חומצה חנקתית במשך 15 דקות. לנגב קונוסים עם 5% חומצה חנקתית. לשנות את הצינורות ההפריסטית. תבדוק את רמת שמן המשאבה.
- תדליק את הארגון והצ'ילר, תתחיל פלזמה. התחל זרימה נוזלית לתוך פלזמה ולחכות המכשיר לייצב, כ 20 דקות.
- מטב את מתחי העדשה. הפעל בדיקת ביצועים יומית על-ידי מדידת פתרונות בדיקה המכילים Mg, In ו- שלך כדי לאשר את הרגישות של מכשיר ICP-MS. מדוד Ce ו- Ba שבו טופס תחמוצת ויונים טעונים כפולים צריך להישאר מתחת 3%. בדוק את המסה ב 8 ו 220 Da כדי למדוד את אות הרקע.
- הכלי מוכן כעת לשימוש.
4. בחירת שיטת המשתמש ורשימת דוגמאות
- בחר אלמנט ואיזוטופים של עניין.
- בחר מצב סריקה כקפיצה על שיא.
- בחר זמן התעכבות של 100 אלפיות שני (מינימום 50) עם 40 סריקות (מינימום 15) לקריאה. בחר קריאה אחת לכל שכפול ו- 5 משכפלים (מינימום 3). זמן האינטגרציה הכולל הוא 4,000 ms. אם כמות המדגם מוגבלת, צמצם את זמן ההשתהות, מספר הסריקות והשכפולים תוך שמירה על ערכים גבוהים יותר מערכי המינימום שהוגדרו לעיל.
- השתמש בקצב זרימה של אמוניה (NH3) ב 0.7 מ"ל / דקה כדי למנוע את ההפרעה של 40Ar16O על הקביעה של 56Fe.
- הכן עקומת כיול עבור האלמנטים המועדפים.
- תריץ את הדגימות.
ספקטרומטריית מסה היא טכניקה אנליטית המאפשרת זיהוי וכימות של תרכובות לא ידועות בתוך מדגם, ואת קביעת המבנה שלהם.
בספקטרומטריית מסה, יונים שלב גז נוצרים מן האטומים או מולקולות במדגם. לאחר מכן, היונים מופרדים על סמך יחס המסה-לטעינה שלהם, המסומל על-ידי m/z.
הפרדה זו מאפשרת קביעת מידע כמותי ואיכותי על מדגם, כגון המסה והמבנה שלהם.
וידאו זה יציג את המושגים הבסיסיים ואת המכשור של ספקטרומטריית מסה, ולהדגים את השימוש בו כימות אלמנטים.
ספקטרומטר מסה מורכב ממקור יינון, מנתח מסות וגלאי. במקור היוניזציה, התרכובות מיוננות, בדרך כלל למטען חיובי יחיד.
יונים יכולים להיווצר בטכניקות שונות, כגון פגיעה בקרן אלקטרונים, פלזמה או לייזרים, כל אחד מהם וכתוצאה מכך מגוון של פיצולים המסייעים בקביעת המבנה המולקולרי. שיטות אלה מקובצת באופן רופף ליינון "קשה" ו"רך".
טכניקות יינון קשות גורמות לפיצול נרחב, וכתוצאה מכך יותר שברים של מסה נמוכה יותר.
טכניקות יינון רכות גורמות לפיצול פחות, או כמעט לא, עם טווח מסת מולקולרי גבוה.
אם הפיצול גדול מדי, מידע מבנה בעל ערך יכול ללכת לאיבוד. אם זה מעט מדי, מולקולות קטנות לא יהיו מיוננות ביעילות. לפיכך, הבחירה בשיטת יינון תלויה באנתוח העניין ובמידה הרצויה של פיצול.
לאחר מכן האינים מואצים בשדה חשמלי כשהם נכנסים לניתוח המסה, שם הם יופרדו.
מנתח המסה הבסיסי ביותר הוא מגזר מגנטי, המורכב ממגנט מעוקל המייצר שדה מגנטי הומוגני. הכוח האטרקטיבי של המגנט, בתוספת הכוח הצנטריפוגלי של היונים המאיצים גורם להם לנוע בנתיב מעגלי דרך העקומה.
רדיוס הנתיב המעגלי של היונים תלוי במתח המאיץ, בשדה המגנטי המיושם וביחס המסה למטען.
לאחר מכן ניתן לבחור את המתח והשדה המגנטי כדי לאפשר רק מינים מסוימים של יחס מסה-טעינה דרך הנתיב המעוקל. יונים אחרים מתרסקים לתוך צידי המסלול המגנטי והם הולכים לאיבוד. על ידי סריקת עוצמת השדה המגנטי, היונים הרצויים מגיעים לגלאי בזמנים שונים, ובכך מזהים כל מין במדויק.
סוג נוסף של מנתח מסות הוא מסנן המסה של quadrupole. הקוואדרופול מורכב משני זוגות של מוטות מתכת מקבילים, כאשר כל זוג מוטות מנוגדים מחובר חשמלית.
מתח זרם ישיר מוחל על זוגות המוטות, והפוטנציאלים שלהם לסירוגין ברציפות כך שהזוגות תמיד מחוץ לפאזה עם השני.
קרן היונים מכוונת דרך מרכז ארבעת המוטות. יונים נוסעים בנתיב דמוי חולץ פקקים, בשל המשיכה המתמדת והדחייה מהמוטות. בהתאם ליחס המסה לטעינה של היונים, היון ינוע בנתיב המלא של הרביעייה ויגיע לגלאי, או יתרסק לתוך המוטות.
כעת, לאחר שתואר יסודות ספקטרומטר המסה, בואו נבחן את השימוש בו במעבדה.
ספקטרומטר המסה המשמש בניסוי זה הוא פלזמה מצמידה, או ICP, מיינן, עם מסנן מרובע. המכשיר ישמש לזיהוי וכימות של רכיב מתכת במדגם.
כדי להתחיל את הניסוי, מלא את כל צינורות פוליפרופילן עם 5 מ"ל של 0.1 M חומצה הידרוכלורית על מנת להסיר כל עקבות מזהמים של ברזל. מניחים את הצינורות באמבט מים במשך שעה אחת ב 50 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, לשטוף את הצינורות עם 5 מ"ל של מים deionized, ולייבש את הצינורות בתנור או מכסה המנוע הכימי.
בצינורות נקיים, להוסיף 1.8 מ"ל של חומצה חנקתית מרוכזת ו 200 μL של מדגם המכיל איזוטופ של עניין.
יש לעקוב אחר אמצעי הבטיחות בעת שימוש בחומצה מרוכזת.
מניחים את הצינורות באמבט מים למשך הלילה. ניתן להגדיל את הטמפרטורה כדי לקצר את זמן העיכול, במידת הצורך.
לאחר הדגימה מתעכלת, תן את הצינורות להתקרר לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, להוסיף 8 מ"ל של מים deionized כדי לדלל את הדגימות, ולקבל ריכוז חומצה חנקתית מתחת 20%. הדילול הסופי של המדגם הוא 1/50. הריכוז האידיאלי עבור ICP הוא בטווח החלקים למיליארד. צנטריפוגות הצינורות כדי כדורי כל שאריות מקרוסקופיות הנותרות.
ICP היא שיטה של יינון קשה המשתמשת פלזמה ארגון מצמיד בכ 10,000 °C כי הוא מוליך חשמלית כדי לייינון מולקולות המדגם.
התחל את המכשיר שהוקם על ידי בדיקת לפיד ICP כדי לוודא שהוא נקי.
לאחר מכן, בדוק את קונוסים סמפלר ורחפן כדי להבטיח שהם גם נקיים. קונוסים אלה מאפשרים דגימה של החלק הפנימי של קרן היון שנוצר על ידי לפיד ICP ומשמשים כמחסום לוואקום הגבוה של ספקטרומטר המסה.
בדוק את לחץ הארגון ולהתחיל את הצ'ילר. התחל את זרימת הפלזמה והנוזל לתוך המערכת. המתן 20 דקות עד שהמערכת תהתחמם במלואה.
לאחר מכן, שאפו לפתרון בדיקה סטנדרטי, המכיל סטנדרטים אלמנטיים ידועים שונים. יש לבחור את פתרון הבדיקה כדי לכסות את טווח המסה הצפוי של פתרון הניתוח.
כאשר זרימת הפתרון נקבעת, אתחל ובדוק את המכשיר בהתאם להנחיות היצרן.
כדי להפעיל את המכשיר, בחר תחילה את האלמנטים והאיזוטופים של עניין. לאחר מכן הגדר את מצב הסריקה לקפיצה לשיא.
בחר חמישה עותקים משוכפלים לכל מדידה. הגדר כל שכפול כך שיכיל 40 סריקות מדידה, כל סריקה עם זמן השתהות של 50 אלפיות השנייה. זמן האינטגרציה הכולל הוא 2,000 מילרט לכל שכפול.
הכן עקומת כיול לאלמנטים המועדפים על-ידי מדידת פתרונות סטנדרטיים מוכנים מראש.
לבסוף, להפעיל את המדגם, במקרה זה, חלקיקי תחמוצת ברזל. קבע את ריכוז הברזל באמצעות עקומת כיול הברזל.
ספקטרומטריית מסה משמשת במגוון רחב של יישומים באמצעות יינון שונים וטכניקות ניתוח מסה.
בדוגמה זו, סוג של ספקטרומטריית מסה יינון רכה, הנקראת מטריצה בסיוע לייזר desorption יינון זמן טיסה, או MALDI-TOF, שימש לניתוח חלבונים במשקל מולקולרי גבוה. עם MALDI, מולקולות מתייצבות עם מטריצה, כדי להקטין את השבר כאשר המולקולות הגדולות מיוננות.
תמיסה חלבון ותמצית היו שניהם הבחינו על צלחת MALDI נקי, ויובש. לוחית ה-MALDI הוכנסה למכשיר, והדגימה נותחה.
הניתוח של תרכובות רגישות נדיפות וחמצון נמדד באמצעות ספקטרומטריית מסה יינון אלקטרונים, טכניקת יינון קשה.
ראשית, מערכת צינור לנעילה תוכננה על מנת לאפשר פינוי מלא של הצינור, ואחריו טעינת המדגם תחת קירור על ידי חנקן נוזלי.
צינור הדגימה היה מחובר ליציאת הכניסה, והדגימה נטענה לתוך המכשיר. ספקטרום המסה של המדגם במקרה זה טריס (טריפלואורומטיל) פוספט, נותח לאחר מכן.
ספקטרומטר מסת קרן מולקולרית בשילוב עם קרינת סינכרוטרון שימש לחקור את המבנה האלקטרוני של מולקולות שלב גז ואשכולות.
הקרן המולקולרית, המשולבת בקרינת סינכרוטרון, סיפקה שיטת יינון סלקטיבית לבדיקת מולקולות בשלב הגז.
הדגימה נטענה לתוך הזרבובית, הזרבובית נטענה מחדש לתוך המכשיר, וקרן הפוטן הורשתה להיכנס לתא.
ספקטרום המסה נאסף אז והושווה לנתוני יעילות פוטוניזציה על מנת לקבוע את המבנה האלקטרוני של מולקולות.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לספקטרומטריית מסה. עכשיו אתה צריך להבין את המכשור הבסיסי של ספקטרומטריית מסה, וכיצד להפעיל ניתוח בסיסי מבוסס ספקטרומטריית מסה.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
ניתוח ICP-MS של דגימות המכילות חלקיק תחמוצת ברזל מוצג להלן. עקומה סטנדרטית בוצעה בריכוז ידוע של 56Fe (איור 1). מקדם המתאם קרוב ל- 1 (R2 = 0.999989) הראה את הקשר הליניארי הטוב בין ריכוזי המדגם לבין העוצמה הנמדדת על ידי הגלאי. דוגמאות של תחומי עניין הראו ערכים בטווח הכיול(איור 2). הריכוזים שחושבו על ידי התוכנה הותאמו לאחר מכן על פי הדילול שבוצע במהלך הפרוטוקול. הפרוטוקול הנוכחי תיאר דילול של 1/50 בעקבות דילול בחומצה (1/10) ובמים מילי-Q (1/5). לדוגמה, נמדד ריכוז של 51.427 מיקרוגרם/L עבור המדגם 51 (איור 2). ריכוז המדגם המקורי היה גבוה פי 50 מ"ג/ל'.
איור 1. עקומת כיול עבור מדידות Fe 56. ארבע נקודות סטנדרטיות (0.01, 0.1, 1 ו- 10 מיקרוגרם/מ"ל) מציגות מקדם מתאם (R2) של 0.999989. זה מאשר את הקשר הליניארי הטוב בין עוצמת האות שזוהתה לבין ריכוזי ההתייחסות.
איור 2. תוצאות מייצגות בעקבות מדידות ICP-MS על דגימות חלקיק תחמוצת ברזל. הריכוז של כל דגימה מדוללת מחושב באופן אוטומטי על פי עקומת הכיול המוגדרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
השדות הסביבתיים וההיאולוגיים מייצגים את השימוש הראשון עבור ICP-MS למשל למדידת מזהמים הקיימים במים, בקרקע או באטמוספירה. נוכחות של מזהמים בריכוז גבוה במי ברז כגון Fe, Cu, או Al ניתן לפקח באמצעות ICP-MS.
תחומי המדע הרפואי והמז"פ משתמשים גם בזיהוי ICP-MS. במקרה של חשד להרעלת מתכת כגון ארסן, ניתן לנתח דגימות כגון דם ושתן באמצעות ICP-MS. טכניקה זו יכולה גם לספק מידע בעל ערך במקרה של פתולוגיה המערבת חששות מטבוליים או בעיות הפטולוגיות וכתוצאה מכך הפרשה לקויה של אלמנטים מסוימים.
ICP-MS מאפשר כימות של מתכות בכל חומר. באיור 3נמדד ריכוז ה-Fe בננו-חלקיקים וקשור למאפייני הדמיית התהודה המגנטית שלהם (MRI). ICP-MS מספק כימות אמין של Fe של חלקיקים שונים כדי להפלות אילו חלקיקים הם היעילים ביותר עבור יישום הדמיה.
יישום נוסף הוא לחקור את biodistribution של חלקיקים הקשורים מתכות. איור 4 מציג את ההזרקה הביולוגית של האיברים של חלקיקים המכילים תחמוצת ברזל בעכברים לאחר הזרקה תוך ורידי. בשעה 24 שעות, כל איבר נאסף ומעוכל בחומצה חנקתית מרוכזת עד לעיכול איברים מלא. ריכוז 56Fe היה כימות על ידי ICP-MS. התוצאות מראות ריכוז גבוה יותר של 56Fe בכבד טחול לעכברים מוזרקים עם חלקיקים מאשר באיברים מבעלי חיים תמימים. לכן, סוכם כי חלקיקים מצטברים בעיקר לתוך כבד ואיברי טחול.
איור 3. הדמיית תהודה מגנטית (MRI) מדידה של פונקציית חלקיקים של ריכוז Fe שלהם. חמישה ריכוזי ברזל שימשו (0.25, 0.5, 0.75, 1 ו-1.25 מ"מ) שצוו עבור תכונות ה-MRI שלהם (קצב הרפיה, R2*).
איור 4. ייחוס ביולוגי של חלקיקי תחמוצת ברזל בעקבות הזרקה תוך ורידי בעכברים. דגימות תמימות מראות את רמת האיברים הבזלית של ברזל בעכברים לא מטופלים. לאחר הזרקת חלקיקים המכילים תחמוצת ברזל, כמות הברזל באיברים מסוימים עולה אשר קשורה הצטברות של חלקיקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
