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Cell Biology

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Overview

세포 주기는 세포가 성장하고, 게놈을 복제하고, 궁극적으로 미토시스 과정을 통해 2개의 딸 세포로 분할하는 사건의 집합을 말합니다. 세포내 DNA의 양은 주기 전반에 걸쳐 특징적인 변화를 나타내기 때문에, 세포 주기 분석으로 알려진 기술은 그들의 변화하는 DNA 함량에 기초하여 세포 주기의 상이한 단계에 따라 세포의 인구를 분리하는 데 사용될 수 있다.

이 비디오는 DNA 염색을 통해 세포 주기 분석의 뒤에 원리를 다룰 것입니다. 우리는 브로모톡시우리딘 (BrdU, 새로 합성 된 DNA 가닥에 통합되는 티미딘 아날로그)와 프로피듐 요오드 (PI, 모든 DNA를 얼룩진 DNA 염료)를 사용하여이 염색 프로토콜을 수행하기위한 일반화 프로토콜을 검토하고, 흐름 세포와 염색 된 세포의 분석. 유동 세포 분석 동안, 형광 표지 된 세포의 단일 세포 현탁액은 레이저 빔과 기기를 통해 전달되고 각 세포의 형광이 읽혀지는다. 그런 다음 흐름 사이토메트릭 분산 플롯에서 데이터를 해석하는 방법에 대해 설명하고 마지막으로 이 기술의 몇 가지 응용 프로그램을 살펴봅니다.

Procedure

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세포 주기는 그것의 분할로 이끌어 내는 세포 내에서 생기는 세포 및 생화확적인 프로세스의 세트를 말합니다. 세포는 주기의 다른 단계를 통과하고, 이 과정을 완료하는 데 걸린 시간은 세포 유형에 대해 거의 일정합니다. 이 기간에서 어떤 편차는 이상한 세포 분열을 나타냅니다. 따라서 세포 주기 분석은 세포 분열의 메커니즘을 연구하는 데 관심이있는 생물학자에게 매우 유용한 도구가되며, 궁극적으로 세포 주기가 중단되는 암과 같은 질병을 가진 환자를 치료하는 데 도움이됩니다.

이 비디오는 세포 주기 분석의 원리와 일반화 된 프로토콜에 대해 설명합니다. 마지막으로, 이 일반적으로 사용되는 방법의 일부 응용 프로그램을 보여 드리겠습니다.

세포 주기 분석이 무엇인지, 그리고 이 분석이 어떻게 작동하는지 알아보겠습니다.

본질적으로, 혼합 된 인구의 세포 주기 분석은 서로 다른 단계의 각각에 얼마나 많은 세포가 있는지 알려줍니다. 이것은 세포의 DNA 내용을 평가하여 가장 일반적으로 행해지습니다. 당신은 생각할 수 있습니다 : 왜 DNA 함량? 이를 이해하려면 세포가 주기를 통해 진행됨에 따라 염색체 DNA에 어떤 일이 일어나는지 간략하게 검토해 봅시다.

G1 단계 동안 세포 내의 DNA 함량은 변하지 않습니다. S 단계를 통해 DNA 복제가 이루어지며, 이 단계의 끝으로 DNA 함량이 두 배가 됩니다. G2 단계에서 세포는 DNA 중복에 오류가 없음을 확인하고, 마지막으로 M 단계의 끝에서 -이 DNA는 동등하게 두 딸 세포로 분할됩니다. 따라서 DNA를 라벨링하면 과학자가 세포 주기 단계를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 라벨링에 대한 한 가지 중요한 고려 사항은 DNA 결합 염료의 선택입니다. 브로모톡시리딘(BrdU)은 핵산 유사체이며 구조적으로 티미딘을 모방한다. 이를 통해 BrdU는 DNA 복제 중에 성장하는 가닥에 통합할 수 있습니다. 따라서 이 염료는 S 상에서만 세포를 레이블로 지정합니다. BrdU 통합 후 DNA 가닥이 분리되고 BrdU는 형광 태그 항체의 도움으로 검출됩니다.

본질적으로 형광인 프로피듐 요오드 또는 PI와 같은 다른 화합물은 이중 가닥 핵산 사이에 상호 작용하여 모든 단계에서 얼룩세포를 혼합합니다. 그러나, PI 염색의 양은 DNA 양에 비례한다.

얼룩의 선택은 손에 실험에 따라 달라집니다 있지만, 연구원은 종종 이중 염색 절차를 사용합니다. 모든 세포에 비례적으로 결합하는 PI와 같은 분자는 G2 또는 M 상 세포로부터 G1 세포를 쉽게 분화할 수 있습니다. 그러나, S 상 세포는 여전히 전이중이다. 따라서, S상 세포만 표시하는 BrdU와 같은 분자의 첨가는 세포 주기 단계 검출의 특이성을 증가시다. 마지막으로, 세포는 다른 세포 주기 단계에서 세포를 예중화하기 위하여 유동 세포측정을 사용하여 분석됩니다.

이제 세포 주기 염색의 원리를 이해되었으므로 BrdU 및 PI를 사용하여 절차에 대해 논의해 보겠습니다.

세포 배양 접시 설정: 실험을 위한 1개, 컨트롤로 추가 세 가지. 약 60%의 합류에서 배양 배지에 용해된 BrdU가 살아있는 세포에 첨가되고 배양이 뒤따릅니다. 이 단계에서, BrdU는 복제 DNA 안에 통합됩니다.

배양 후, 세포는 원심분리되고 인산염 완충식염수또는 PBS로 재장매된다. 다음으로, 세포는 부드럽게 소용돌이치면서 얼음 감기 70% 에탄올에 세포 현탁액을 떨어뜨려 고정합니다. 이렇게 하면 세포 분열이 중단되고 응집을 방지합니다.

고정 된 세포는 다시 원심 분리 및 PBS에서 다시 중단됩니다. 이어서, 트리톤-X와 같은 세제를 함유하는 농축산 용액이 세포에 드롭와이즈로 첨가된다. 세제는 세포가 막 불투과성 화합물의 진입을 허용하도록 세포를 투과화하고 산은 pH를 감소시키고 DNA를 변성하여 BrdU를 노출시킵니다. 세포는 원심분리되고, 상피가 버려지고, 펠릿은 pH를 복원하기 위해 알칼리성 용액에서 다시 매복된다.

마지막으로, 세포는 PBS로 세척되고 실온에서 형광 태그에 컨쥬게이징된 BrdU 항체로 배양됩니다. 이 단계 후, 샘플은 광표백을 피하기 위해 빛으로부터 보호되어야 합니다.

이중 염색 시 세포는 PI와 RNase로 배양됩니다. RNase는 또한 PI에 결합하고 거짓 양성 결과를 산출할 수 있는 RNA-RNA 또는 RNA-DNA 이중 가닥을 제거하기 위하여 필요합니다. 세포는 그 때 유동 세포 측정 분석에 필요한 단하나 세포 현탁액을 만들기 위하여 세포 여과기를 통과합니다.

염색 프로토콜을 배웠으니 얻은 데이터를 분석하는 방법을 살펴보겠습니다.

간략하게, 유동 세포면에서 레이저 빔은 단일 세포 현탁액의 좁은 스트림에 빛나고, 각 셀의 염료로부터특정 파장의 방출은 분산 플롯에서 단일 이벤트로 검출된다.

여기서, PI 염색 된 세포의 분산 플롯은 두 개의 별개의 클러스터를 나타내며, 하나는 다른 것보다 PI의 거의 두 배의 양을 갖는다. PI 검출기의 최적화에 따라 이러한 세트는 히스토그램 분석에서 두 개의 피크로 나타납니다. 더 큰 PI 강도의 피크는 G2/M 세포를 나타내고, 더 낮은 강도의 세포는 G1 세포를 나타낸다. 이러한 피크 아래에 있는 영역은 해당 상에서 셀 수를 나타냅니다.

마찬가지로 BrdU-FITC 이벤트는 로그와스믹 스케일의 히스토그램 분석에 표시될 수 있습니다. 이 줄거리는 BrdU 양성 세포가 얼룩지지 않은 세포보다 뚜렷하게 밝고, 인구의 일부만이 S 단계에 있기 때문에 BrdU 비스테인 세포의 더 큰 피크를 볼 수 있음을 보여줍니다.

BrdU 및 PI로 염색된 세포의 분산 플롯은 로그리스믹 Y축의 선형 X축 및 BrdU에 PI로 표시할 수 있으며, 이는 G1, S, G2로 가는 말굽 패턴을 나타낸다. 게이트 영역의 셀 비율을 결정하고 막대 그래프에 표시할 수 있습니다.

이제 세포 주기 분석을 위한 기본 프로토콜을 살펴보았으니 다양한 실험 설정에서 어떻게 사용할 수 있는지 살펴보겠습니다.

A. 세포 주기 분석과 유전 조작을 결합하 여, 과학자 세포 주기 진행에 특정 단백질의 역할을 연구. 이 연구에서 과학자들은 마우스 배아 섬유아세포에서 p27이라는 단백질을 과발 표현했습니다. 결과는 과발현이 세포 주기 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 나타내는 S 단계에서 세포의 더 낮은 수로 이끌어 냈습니다.

과학자들은 세포 주기 분석을 사용하여 진행 역학을 비교할 수 있습니다. 여기서, 2개의 대장암 세포주와 유방암 세포 주 사이의 진행 운동학을 비교했다. 결과는 유방암 세포가 시간이 지남에 따라 G1에 있는 유방암 세포의 더 높은 비율을 주어진 colorectal 세포주에 비해 느린 비율로 세포 주기를 통해 점진했다는 것을 보여주었습니다.

마지막으로, 생체 내 세포 주기 분석을 위해, BrdU는 설치류에 주입될 수 있고 표적 세포 집단은 세포 주기 분석을 위해 단화될 수 있다. 이 연구에서는, 브르두에 주입된 마우스의 조혈 줄기 세포 또는 HSC는 유동 세포 측정 분석을 위해 고립되었다. 수집된 데이터는 G1 및 S 단계에서 우세한 다른 세포 주기 단계 사이에서 HSC의 분포를 밝혔습니다.

세포 주기 분석에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 이 프로세스의 원리를 검토하고 단계별 프로토콜을 자세히 설명했으며 이러한 유형의 분석이 다양한 실험 환경에서 어떻게 사용되는지 검토했습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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