Overview
細胞周期は、細胞成長、そのゲノムを複製し、最終的に有糸分裂のプロセスを 2 つの娘細胞に分割されるイベントのセットを指します。セルに DNA の量は細胞周期の分析は、彼らは、細胞サイクルのさまざまな段階に応じてセルの人口を分離する使用ことができます知られている技術サイクル、特性の変化を示しています、ので彼らのさまざまな DNA の内容に基づいています。
このビデオは、DNA 染色による細胞周期解析の背後にある原理を説明します。私たちはこの染色を使用して実行するための一般的なプロトコルを確認ブロモデオキシウリジン (BrdU、チミジン アナログ新規合成された dna に組み込まれている) propidium ヨウ化 (PI、汚れをすべて DNA DNA 色素)、続いてフローサイトメトリーによる染色の細胞の解析。Cytometry 流れの中に蛍光に分類された細胞の単一細胞懸濁液をレーザー光線で計測器を通過し、各細胞の蛍光を読み取る。流れフローサイトメトリーによる散布からのデータを解釈する方法を説明します、最後に、この手法のいくつかのアプリケーションを見ています。
Procedure
細胞周期は、その部門につながる細胞の内で発生する細胞および生化学的なプロセスのセットを指します。セルはサイクルのさまざまな段階を通過し、このプロセスを完了するのにかかる時間は細胞の種類によりほぼ一定。この期間からの逸脱は、異常な細胞分裂を表しています。したがって、細胞周期解析最終的に癌、細胞周期は中断されるのような疾患を持つ患者の治療に役立つ細胞分裂機構の研究に興味がある生物学者にとって非常に有用なツールになります。
このビデオは、原則および細胞周期解析の一般化されたプロトコルについて説明します。最後に、このアプリケーションはよく使われる方法を紹介します。
どのような細胞周期の分析であり、この試金のしくみを勉強しましょう。
基本的に、混合された人口の細胞周期の分析は、どのように多くの細胞は、それぞれ異なる段階を教えてくれる。細胞の DNA の内容を評価することによってこれは最も一般的です。あなたは思うかもしれません: なぜ DNA 量ですか?これを理解するには、簡単に見直そうサイクルで細胞が進むにつれて染色体 DNA に起こる。
G1 期の中にセル内の DNA の内容は変更されません。S 段階によって DNA の複製が起こるし、この段階 DNA の端によりコンテンツが 2 倍します。G2 段階でセルは、DNA の複製にエラーがないことをチェックし、最後に-M ステージの終わりに-この DNA を取得します 2 つの娘細胞に均等に分割します。したがって、DNA を標識細胞周期の段階を決定する科学者を助けることができます。
このラベルの 1 つの重要な考慮事項は、DNA 結合色素の選択です。ブロモデオキシウリジン、または BrdU、核酸アナログは、構造的にチミジンを模倣しています。これは DNA 複製時に成長のストランドに組み込む BrdU をことができます。したがって、この染料は、S 期だけで細胞をラベル付けします。次の BrdU 取り込み、DNA の繊維を分離し、蛍光付けられた抗体の助けを借りて、BrdU を検出します。
Propidium ヨウ化または本質的に蛍光である PI などの他の化合物は、二重の鎖核酸間インターカ レート、したがって染色細胞があらゆる段階します。ただし、PI 染色の量は DNA 量に比例します。
汚れの選択により異なります手での実験、研究者はしばしば二重染色の手順を使用します。比例して、すべてのセルにバインド PI が簡単にできるような分子は、G2 から G1 セルや M 期の細胞を区別します。ただし、S 期の細胞は転移中です。したがって、分子添加 BrdU ラベル S 期の細胞のみが細胞周期段階検出の特異性を高めることのような。最後に、細胞分析フローサイトメトリーを使用して異なった細胞周期の段階で細胞を列挙します。
今では細胞周期の染色の背後にある原理を理解すると、BrdU と PI を使用して手順を説明しましょう。
細胞の培養皿を設定する: 1 つの実験、およびコントロールとして追加 3。約 60% で合流、BrdU 培地の溶解が潜伏が続く、生きているセルに追加されます。この段階で、BrdU は複製 DNA 内に組み込まれました。
次の培養細胞は遠心分離、リン酸緩衝生理食塩水、または PBS で再停止されます。次に、細胞は優しくボルテックス中冷たい 70% エタノールに細胞懸濁液を滴下し追加で修正されます。これは、細胞分裂を停止し、ダマを防ぐ。
固定セルを遠心分離して再び PBS で再停止されます。その後、濃縮酸溶液トリトン X などの洗剤は、滴下のセルに追加されます。洗剤 permeabilizes 膜不浸透性化合物のエントリを許可する細胞と酸は pH が減少、BrdU を公開する DNA を変化します。セルは遠心し、上清を破棄すると、ペレットはアルカリ性 pH を復元で再停止されます。
最後に、細胞を PBS で洗浄し、室温での蛍光タグに共役 BrdU 抗体とインキュベートします。この手順の後のサンプルは、退色を避けるために光から保護されるべき。
とき二重染色、細胞は PI と RNase と孵化させます。RNase は RNA DNA または RNA の二重鎖も PI にバインドし、偽陽性の結果を得ることができますを削除する必要は。セルは、セル ストレーナー フローサイトメトリーによる解析に必要な単一細胞の懸濁液に渡されます。
今では汚損のためのプロトコルを学んできた、得られたデータを分析する方法を確認してみましょう。
簡単に言えば、流れ cytometry 単一細胞懸濁液の狭いストリームと各セルの染料から特定の波長で発光にレーザービームを当てる散布に単一のイベントとして検出されます。
ここでは、円周率の散布はセルを 2 つのクラスターは、他よりも PI のほぼ 2 倍量のいずれかを染色しました。PI 検出器の最適化、次のこれらのセットは、ヒストグラム解析の 2 つのピークとして表示されます。大きい PI 強度のピークは G2/M 細胞を表し、低い強度で 1 つ G1 セル。これらのピークの下の領域は、対応する段階で細胞の数を表しています。
同様に、BrdU FITC イベントは、ヒストグラム解析では対数目盛で表示できます。このプロットは、BrdU 陽性細胞無染色の細胞よりもはっきりと明るく、人口のほんの一部から S 期、BrdU の大きいピークで無染色の細胞を見ることができることを示しています。
線形の x 軸に PI と対数の y 軸に BrdU BrdU と PI 染色細胞散布を表示できから G1、S、G2 になる馬蹄形パターンを表示します。ゲート領域内のセルの割合を決定し、棒グラフの表示できます。
今では細胞周期の分析の基本的なプロトコルを介して行ってきた、様々 な実験のセットアップでの使い方を見てみましょう。
A. 細胞周期解析と遺伝子操作を用いて、科学者たちは細胞周期の進行の特定の蛋白質の役割を学ぶ。本研究では、科学者は、p27 をマウス胚性線維芽細胞と呼ばれるタンパク質を過剰発現。結果は過剰発現を示すこの蛋白質が細胞周期の調節に重要な役割を果たしていることを示す S 期の細胞の数を下げるために導いた。
科学者は、細胞周期解析を使用すると、進行速度を比較できます。ここでは、2 つの大腸癌細胞株と乳房癌細胞株の進行速度を比較しました。結果は、乳癌細胞が時間をかけて、G1 の乳癌細胞の割合を与え大腸細胞株と比較して遅い速度で細胞周期を進行したことを示した。
最後に、生体内で細胞周期の分析のため BrdU は齧歯動物で注入することができます、ターゲット セル人口は細胞周期の分析の分離することができます。この研究では、造血幹細胞または造血の BrdU 注入マウスはフローサイトメトリーによる解析のため分離されました。収集されたデータは、G1 と S の段階で優位性と異なった細胞周期の段階の中で造血の分布を明らかにしました。
細胞周期解析にゼウスのビデオを見てきただけ。私達はこのプロセスの背後にある原則を見直し、詳しいステップバイ ステップ プロトコル、さまざまな実験的設定でこのタイプの分析を使用する方法を確認します。いつも見てくれてありがとう!
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