Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Cell Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

ניתוח מחזור תא

Overview

מחזור התא מתייחס למערך האירועים שדרכם גדל תא, משכפל את הגנום שלו, ובסופו של דבר מתחלק לשני תאי בת בתהליך של מיטוזה. מכיוון שכמות הדנ"א בתא מראה שינויים אופייניים לאורך המחזור, ניתן להשתמש בטכניקות המכונות ניתוח מחזור התאים כדי להפריד אוכלוסיית תאים בהתאם לשלבים השונים של מחזור התאים בהם הם נמצאים, בהתבסס על תוכן ה- DNA המשתנה שלהם.

וידאו זה יכסה את העקרונות מאחורי ניתוח מחזור התא באמצעות מכתים DNA. אנו נסקור פרוטוקול כללי לביצוע הכתמים באמצעות ברומודוקסיורידין (BrdU, אנלוגי תימידין המשולב בגדילי DNA מסונתזים חדשים) ופרופידיום יודיד (PI, צבע DNA שמכתים את כל ה- DNA), ואחריו ניתוח של התאים המוכתמים עם ציטומטריית זרימה. במהלך ציטומטריית הזרימה, השעיית תא בודד של תאים בעלי תווית פלואורסצנטית מועברת דרך מכשיר עם קרן לייזר והפלואורסצנטיות של כל תא נקראת. לאחר מכן נדון כיצד לפרש נתונים ממגרשי פיזור ציטומטריים של זרימה, ולבסוף, נבחן כמה יישומים של טכניקה זו.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחזור התא מתייחס למערך התהליכים התאיים והביוכימיים המתרחשים בתוך תא המוביל לחלוקתו. תא עובר בשלבים שונים של המחזור, והזמן שנדרש להשלמת תהליך זה הוא כמעט קבוע עבור סוג תא. כל סטייה ממשך זמן זה מעידה על חלוקת תאים חריגה. לכן, ניתוח מחזור התא הופך להיות כלי שימושי מאוד עבור ביולוגים המעוניינים ללמוד מנגנונים של חלוקת תאים, אשר בסופו של דבר יסייע בטיפול בחולים עם מחלות כמו סרטן, שבו מחזור התא הוא שיבש.

וידאו זה ידון בעיקרון ובפרוטוקול כללי של ניתוח מחזור התא. לבסוף, נראה כמה יישומים של שיטה נפוצה זו.

בואו נלמד מה זה ניתוח מחזור תאים, ואיך הבדיקה הזו עובדת.

בעיקרו של דבר, ניתוח מחזור התא של אוכלוסייה מעורבת אומר לנו כמה תאים נמצאים בכל אחד מהפעיפים השונים. זה נעשה בדרך כלל על ידי הערכת תוכן ה- DNA של התא. אתם עשויים לחשוב: מדוע תכולת דנ"א? כדי להבין זאת, בואו נסקור בקצרה מה קורה לדנ"א כרומוזומלי ככל שתא מתקדם במחזור.

במהלך שלב G1, תוכן ה- DNA בתוך תא אינו משתנה. באמצעות שלב S, שכפול DNA מתרחש, ועד סוף שלב זה תוכן ה- DNA מוכפל. בשלב G2, התאים בודקים שאין שגיאות בשכפול DNA, ולבסוף - בסוף שלב M - הדנ"א הזה מחולק באופן שווה לשני תאי בת. לכן, תיוג DNA יכול לעזור למדען לקבוע את שלב מחזור התא.

שיקול חשוב אחד לתיוג זה הוא הבחירה בצבע כריכת DNA. ברומודוקסיאורידין הוא חומצת גרעין אנלוגית ומחקה מבחינה מבנית תימידין. זה מאפשר BrdU לשלב לתוך גדיל גדל במהלך שכפול DNA. לכן, צבע זה מתייג תאים בשלב S בלבד. בעקבות התאגדות BrdU, גדילי ה- DNA מופרדים, ו BrdU מזוהה בעזרת נוגדנים מתויגים פלואורסצנטית.

תרכובות אחרות, כגון פרופידיום יודיד או PI, שהוא פלואורסצנטי מטבעו, intercalate בין חומצות גרעין נטושות כפולות, ולכן כתם תאים בכל השלבים. עם זאת, כמות הכתמת PI היא פרופורציונלית לכמות ה- DNA.

למרות שבחירת הכתם תלויה בניסוי העומד על הפרק, החוקרים משתמשים לעתים קרובות בהליכי הכתמים כפולים. מולקולות כמו PI שנקשרות באופן פרופורציונלי לכל התאים יכולות להבדיל בקלות בין תאי G1 לתאי פאזה G2 או M. עם זאת, תאי פאזה S עדיין נמצאים במעבר. לכן, תוספת של מולקולות כמו BrdU כי רק תווית תאי פאזה S להגדיל את הספציפיות של זיהוי שלב מחזור התא. לבסוף, תאים מנותחים באמצעות ציטומטריית זרימה כדי למנות תאים בשלבי מחזור תאים שונים.

עכשיו שאתה מבין את העקרונות מאחורי מכתים מחזור התא, בואו לדון בהליך באמצעות BrdU ו PI.

הגדירו מנות תרבית תאים: אחת לניסוי, ושלוש נוספות כפקדים. על 60% השפעה, BrdU מומס במדיה התרבות מתווסף לתאים החיים, ואחריו דגירה. בשלב זה, BrdU משולב בתוך ה- DNA המשכפל.

לאחר הדגירה, תאים הם צנטריפוגות resuspended מלוחים פוספט חוצץ, או PBS. לאחר מכן, תאים קבועים על ידי הוספת השעיית תאים טיפה לקרר קרח 70% אתנול תוך מערבולת בעדינות. פעולה זו מפסיקה את חלוקת התאים ומונעת גושים.

תאים קבועים הם שוב צנטריפוגות ו respended ב PBS. לאחר מכן, תמיסה חומצית מרוכזת המכילה חומר ניקוי, כגון Triton-X, מתווספת לתאים. חומר הניקוי מחלחל לתאים כדי לאפשר כניסה של תרכובות בלתי חדירות לממברנה, וחומצה מקטינה את ה- pH ומדכאת דנ"א, וחושף את BrdU. לאחר מכן תאים הם צנטריפוגה, supernatant הוא השליך, ואת הכדור הוא resuspended בתמיסה אלקליין כדי לשחזר pH.

לבסוף, תאים נשטפים עם PBS ודגרה עם נוגדן BrdU מצומד לתג פלואורסצנטי בטמפרטורת החדר. לאחר שלב זה, דגימות צריך להיות מוגן מפני אור כדי למנוע הלבנת תמונות.

כאשר כתמים כפולים, התאים הם דגירה עם PI ו RNase. RNase יש צורך להסיר גדילים כפולים RNA-RNA או RNA-DNA, אשר גם לאגד PI יכול להניב תוצאות חיוביות שווא. לאחר מכן תאים מועברים דרך מסננת תאים כדי לבצע השעיה של תא בודד, אשר הכרחי לניתוח ציטומטרי זרימה.

כעת, לאחר שלמדתם את הפרוטוקול להכתמה, בואו נסקור כיצד לנתח את הנתונים שהושגו.

בקצרה, בציטומטריית זרימה זורחת קרן לייזר על זרם צר של מתלה תא בודד, והפליטה לאורכי גל מסוימים מהצבעים בכל תא מזוהה כאירוע יחיד על חלקת פיזור.

כאן, חלקת הפיזור של תאים מוכתמים PI להראות שני אשכולות נפרדים, אחד עם כמעט כפול מכמות PI מאשר השני. לאחר אופטימיזציה של גלאי PI, ערכות אלה מופיעות כשתי פסגות בניתוח היסטוגרמה. השיא בעוצמת PI גדולה יותר מייצג תאי G2/M, והפסגה בעוצמה נמוכה יותר מייצגת תאי G1. אזורים תחת פסגות אלה מייצגים את מספר התאים בשלבים המתאימים.

באופן דומה, ניתן להציג את אירועי BrdU-FITC בניתוח היסטוגרמה בקנה מידה לוגריתמי. עלילה זו מראה כי תאים חיוביים BrdU בהירים באופן מובהק מהתאים הלא נגועים, ומכיוון שרק חלק קטן מהאוכלוסייה נמצאים בשלב S, ניתן לראות פסגה גדולה יותר של תאים לא נגועים של BrdU.

ניתן להציג את חלקת הפיזור של תאים מוכתמים ב- BrdU ו- PI עם PI בציר ה- X הליניארי ו- BrdU בציר ה- Y הלוגריתמי, וזה מראה תבנית פרסה שעוברת מ- G1, S, ל- G2. ניתן לקבוע ולהציג את חלקם של התאים באזורים המגודרים בגרף עמודות.

כעת, לאחר שעברנו על הפרוטוקול הבסיסי לניתוח מחזור תאים, בואו נבחן כיצד ניתן להשתמש בו במגוון מערכי ניסוי.

A. על ידי שילוב של מניפולציות גנטיות עם ניתוח מחזור התא, מדענים חוקרים תפקידים של חלבונים ספציפיים בהתקדמות מחזור התא. במחקר זה, מדענים התבטאו יתר על המידה חלבון בשם p27 בפיברובלסטים עובריים של עכברים. התוצאות מראות כי ביטוי יתר הוביל למספר נמוך יותר של תאים בשלב S, מה שמצביע על כך שחלבון זה ממלא תפקיד קריטי בוויסות מחזור התא.

באמצעות ניתוח מחזור התא, מדענים יכולים להשוות קינטיקה התקדמות. כאן הושוו קינטיקה התקדמות בין שני קווי תאים סרטניים המעי הגס וקו תאים של סרטן השד. התוצאות הראו כי תאי סרטן השד התקדמו דרך מחזור התא בקצב איטי יותר בהשוואה לקווי התא המעי הגס, בהתחשב באחוז גבוה יותר של תאי סרטן השד ב- G1 לאורך זמן.

לבסוף, עבור ניתוח מחזור תא vivo, BrdU יכול להיות מוזרק מכרסמים ואת אוכלוסיית תאי היעד ניתן לבודד עבור ניתוח מחזור התא. במחקר זה, תאי גזע hematopoietic או HSCs של עכברים שהוזרקו BrdU היו מבודדים לניתוח ציטומטרי זרימה. נתונים שנאספו חשפו את ההתפלגות של HSCs בין שלבי מחזור תאים שונים עם דומיננטיות בשלב G1 ו- S.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על ניתוח מחזור התא. סקרנו את העקרונות העומדים מאחורי תהליך זה, פירטנו פרוטוקול שלב אחר שלב ובדקנו כיצד נעשה שימוש בסוג זה של ניתוח בהגדרות ניסיוניות שונות. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter