Overview
Il ciclo cellulare si riferisce all'insieme di eventi attraverso i quali una cellula cresce, replica il suo genoma e alla fine si divide in due cellule figlie attraverso il processo di mitosi. Poiché la quantità di DNA in una cellula mostra cambiamenti caratteristici durante il ciclo, le tecniche note come analisi del ciclo cellulare possono essere utilizzate per separare una popolazione di cellule in base alle diverse fasi del ciclo cellulare in cui si trovano, in base al loro diverso contenuto di DNA.
Questo video coprirà i principi alla base dell'analisi del ciclo cellulare tramite colorazione del DNA. Esamineremo un protocollo generalizzato per eseguire questa colorazione utilizzando bromodeossiuridina (BrdU, un analogo della timidina incorporato in filamenti di DNA appena sintetizzati) e ioduro di propidio (PI, un colorante del DNA che macchia tutto il DNA), seguito dall'analisi delle cellule colorate con citometria a flusso. Durante la citometria a flusso, una sospensione a singola cellula di cellule etichettate fluorescentemente viene fatta passare attraverso uno strumento con un raggio laser e viene letta la fluorescenza di ciascuna cellula. Discuteremo quindi come interpretare i dati dai grafici a dispersione citometrica a flusso e, infine, esamineremo alcune applicazioni di questa tecnica.
Procedure
Il ciclo cellulare si riferisce all'insieme dei processi cellulari e biochimici che si verificano all'interno di una cellula che porta alla sua divisione. Una cellula passa attraverso diverse fasi del ciclo e il tempo impiegato per completare questo processo è quasi costante per un tipo di cellula. Qualsiasi deviazione da questa durata è indicativa di una divisione cellulare anormale. Pertanto, l'analisi del ciclo cellulare diventa uno strumento molto utile per i biologi interessati a studiare i meccanismi di divisione cellulare, che alla fine aiuteranno nel trattamento di pazienti con malattie come il cancro, in cui il ciclo cellulare viene interrotto.
Questo video discuterà il principio e un protocollo generalizzato di analisi del ciclo cellulare. Infine, mostreremo alcune applicazioni di questo metodo comunemente usato.
Impariamo cos'è l'analisi del ciclo cellulare e come funziona questo test.
Essenzialmente, l'analisi del ciclo cellulare di una popolazione mista ci dice quante cellule ci sono in ciascuna delle diverse fasi. Questo è più comunemente fatto valutando il contenuto di DNA della cellula. Potresti pensare: perché il contenuto di DNA? Per capire questo, esaminiamo brevemente cosa succede al DNA cromosomico mentre una cellula progredisce attraverso il ciclo.
Durante la fase G1, il contenuto di DNA all'interno di una cellula non cambia. Attraverso la fase S, avviene la replicazione del DNA e alla fine di questa fase il contenuto di DNA viene raddoppiato. Nella fase G2, le cellule controllano che non ci siano errori nella duplicazione del DNA e, infine, alla fine dello stadio M, questo DNA viene equamente diviso in due cellule figlie. Pertanto, l'etichettatura del DNA può aiutare uno scienziato a determinare la fase del ciclo cellulare.
Una considerazione importante per questa etichettatura è la scelta del colorante legante il DNA. La bromodeossiuridina, o BrdU, è un analogo dell'acido nucleico e imita strutturalmente la timidina. Ciò consente a BrdU di incorporarsi nel filamento in crescita durante la replicazione del DNA. Pertanto, questo colorante etichetta le cellule solo in fase S. Dopo l'incorporazione di BrdU, i filamenti di DNA vengono separati e BrdU viene rilevato con l'aiuto di anticorpi marcati fluorescentemente.
Altri composti, come lo ioduro di propidio o PI, che è intrinsecamente fluorescente, si intercalano tra acidi nucleici a doppio filamento e quindi macchiano le cellule in tutte le fasi. Tuttavia, la quantità di colorazione PI è proporzionale alla quantità di DNA.
Sebbene la selezione di una macchia dipenda dall'esperimento in questione, i ricercatori usano spesso procedure di doppia colorazione. Molecole come PI che si legano proporzionalmente a tutte le cellule possono facilmente differenziare le cellule G1 dalle cellule in fase G2 o M. Tuttavia, le celle della fase S sono ancora in transizione. Pertanto, l'aggiunta di molecole come BrdU che etichettano solo le cellule di fase S aumenta la specificità del rilevamento dello stadio del ciclo cellulare. Infine, le cellule vengono analizzate utilizzando la citometria a flusso per enumerare le cellule in diverse fasi del ciclo cellulare.
Ora che hai compreso i principi alla base della colorazione del ciclo cellulare, discutiamo una procedura che utilizza BrdU e PI.
Impostare piatti di coltura cellulare: uno per l'esperimento e altri tre come controlli. A circa il 60% di confluenza, BrdU disciolto nei terreni di coltura viene aggiunto alle cellule vive, seguito da incubazione. In questa fase, BrdU è incorporato all'interno del DNA replicante.
Dopo l'incubazione, le cellule vengono centrifugate e risuscilate in soluzione salina tamponata con fosfato o PBS. Successivamente, le cellule vengono fissate aggiungendo la sospensione cellulare a goccia all'etanolo ghiacciato al 70% mentre girano delicatamente. Questo cessa la divisione cellulare e impedisce l'aggregazione.
Le celle fisse vengono nuovamente centrifugate e risuscilate in PBS. Quindi, una soluzione acida concentrata contenente un detergente, come Triton-X, viene aggiunta alle cellule a goccia. Il detergente permeabilizza le cellule per consentire l'ingresso di composti impermeabili alla membrana e l'acido diminuisce il pH e denatura il DNA, esponendo BrdU. Le cellule vengono quindi centrifugate, il surnatante viene scartato e il pellet viene risusciso in soluzione alcalina per ripristinare il pH.
Infine, le cellule vengono lavate con PBS e incubate con un anticorpo BrdU coniugato a un tag fluorescente a temperatura ambiente. Dopo questo passaggio, i campioni devono essere protetti dalla luce per evitare il fotosableching.
Quando la doppia colorazione, le cellule vengono incubate con PI e RNasi. La RNasi è necessaria per rimuovere i doppi filamenti RNA-RNA o RNA-DNA, che si legano anche alla PI e possono produrre risultati falsi positivi. Le cellule vengono quindi passate attraverso un colino cellulare per produrre una sospensione a singola cellula, necessaria per l'analisi citometrica a flusso.
Ora che hai imparato il protocollo per la colorazione, esaminiamo come analizzare i dati ottenuti.
In breve, nella citometria a flusso un raggio laser brilla su uno stretto flusso di sospensione a singola cellula e l'emissione a particolari lunghezze d'onda dai coloranti in ciascuna cellula viene rilevata come un singolo evento su un grafico a dispersione.
Qui, il grafico a dispersione delle celle colorate PI mostra due cluster distinti, uno con quasi il doppio della quantità di PI rispetto all'altro. Dopo l'ottimizzazione del rilevatore PI, questi insiemi appaiono come due picchi in un'analisi dell'istogramma. Il picco a maggiore intensità PI rappresenta le cellule G2 / M e quello a bassa intensità rappresenta le cellule G1. Le aree sotto questi picchi rappresentano il numero di celle nelle fasi corrispondenti.
Allo stesso modo, gli eventi BrdU-FITC possono essere visualizzati in un'analisi istogramma su scala logaritmica. Questo grafico mostra che le cellule BrdU positive sono nettamente più luminose delle cellule non macchiate, e poiché solo una frazione della popolazione è nella fase S, si può vedere un picco più grande di cellule non macchiate BrdU.
Il grafico a dispersione delle celle colorate con BrdU e PI può essere visualizzato con PI sull'asse X lineare e BrdU sull'asse Y logaritmico, e questo mostra un modello a ferro di cavallo che va da G1, S a G2. La proporzione di celle nelle aree recintate può essere determinata e visualizzata su un grafico a barre.
Ora che abbiamo esaminato il protocollo di base per l'analisi del ciclo cellulare, diamo un'occhiata a come può essere utilizzato in varie configurazioni sperimentali.
Un. Combinando le manipolazioni genetiche con l'analisi del ciclo cellulare, gli scienziati studiano i ruoli di proteine specifiche nella progressione del ciclo cellulare. In questo studio, gli scienziati hanno sovraespresso una proteina chiamata p27 nei fibroblasti embrionali di topo. I risultati dimostrano che la sovraespressione ha portato a un numero inferiore di cellule nella fase S, indicando che questa proteina svolge un ruolo critico nella regolazione del ciclo cellulare.
Utilizzando l'analisi del ciclo cellulare, gli scienziati possono confrontare la cinetica di progressione. Qui, è stata confrontata la cinetica di progressione tra due linee cellulari di cancro del colon-retto e una linea cellulare di cancro al seno. I risultati hanno dimostrato che le cellule del cancro al seno progredivano attraverso il ciclo cellulare a un ritmo più lento rispetto alle linee cellulari del colon-retto, data la più alta percentuale di cellule di cancro al seno nel G1 nel tempo.
Infine, per l'analisi del ciclo cellulare in vivo, BrdU può essere iniettato nei roditori e la popolazione cellulare target può essere isolata per l'analisi del ciclo cellulare. In questo studio, le cellule staminali ematopoietiche o HSC di topi iniettati con BrdU sono state isolate per l'analisi citometrica a flusso. I dati raccolti hanno rivelato la distribuzione delle HSC tra i diversi stadi del ciclo cellulare con predominanza in fase G1 e S.
Hai appena visto il video di JoVE sull'analisi del ciclo cellulare. Abbiamo esaminato i principi alla base di questo processo, dettagliato un protocollo passo-passo e rivisto come questo tipo di analisi viene utilizzato in vari contesti sperimentali. Come sempre, grazie per aver guardato!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
