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Análise do ciclo celular

Overview

O ciclo celular refere-se ao conjunto de eventos através dos quais uma célula cresce, replica seu genoma e, finalmente, se divide em duas células filhas através do processo de mitose. Como a quantidade de DNA em uma célula mostra mudanças características ao longo do ciclo, técnicas conhecidas como análise do ciclo celular podem ser usadas para separar uma população de células de acordo com as diferentes fases do ciclo celular em que estão, com base em seu conteúdo de DNA variado.

Este vídeo cobrirá os princípios por trás da análise do ciclo celular através da coloração de DNA. Revisaremos um protocolo generalizado para a realização desta coloração usando bromodeoxyuridina (BrdU, um análogo de timina que é incorporado em fios de DNA recém-sintetizados) e iodeto de propidium (PI, um corante de DNA que mancha todo o DNA), seguido pela análise das células manchadas com citometria de fluxo. Durante a citometria de fluxo, uma única suspensão celular de células fluorescentes rotuladas é passada através de um instrumento com um raio laser e a fluorescência de cada célula é lida. Em seguida, discutiremos como interpretar dados a partir de gráficos de dispersão citométrica de fluxo e, finalmente, olharemos para algumas aplicações dessa técnica.

Procedure

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O ciclo celular refere-se ao conjunto de processos celulares e bioquímicos que ocorrem dentro de uma célula que leva à sua divisão. Uma célula passa por diferentes estágios do ciclo, e o tempo necessário para completar esse processo é quase constante para um tipo de célula. Qualquer desvio desta duração é indicativo de divisão celular anormal. Portanto, a análise do ciclo celular torna-se uma ferramenta muito útil para biólogos interessados em estudar mecanismos de divisão celular, o que, em última análise, ajudará no tratamento de pacientes com doenças como o câncer, em que o ciclo celular é interrompido.

Este vídeo discutirá o princípio e um protocolo generalizado de análise do ciclo celular. Por fim, mostraremos algumas aplicações deste método comumente usado.

Vamos aprender o que é a análise do ciclo celular, e como esse ensaio funciona.

Essencialmente, a análise do ciclo celular de uma população mista nos diz quantas células estão em cada uma das diferentes fases. Isso é mais comumente feito avaliando o conteúdo de DNA da célula. Você pode pensar: por que o conteúdo de DNA? Para entender isso, vamos rever brevemente o que acontece com o DNA cromossômico à medida que uma célula progride ao longo do ciclo.

Durante a fase G1, o conteúdo de DNA dentro de uma célula não muda. Através da fase S, a replicação do DNA ocorre, e no final desta fase o conteúdo de DNA é dobrado. Na fase G2, as células verificam se não há erros na duplicação do DNA e, finalmente, no final da fase M, esse DNA é dividido igualmente em duas células filhas. Portanto, rotular DNA pode ajudar um cientista a determinar o estágio do ciclo celular.

Uma consideração importante para esta rotulagem é a escolha do corante de ligação de DNA. Bromodeoxyuridina, ou BrdU, é um ácido nucleico analógico e imita estruturalmente a timmidina. Isso permite que brdU incorpore na cadeia crescente durante a replicação do DNA. Portanto, este corante rotula as células apenas na fase S. Após a incorporação da BrdU, os fios de DNA são separados, e brdU é detectado com a ajuda de anticorpos fluorescentes marcados.

Outros compostos, como o iodeto de propídio ou PI, que é inerentemente fluorescente, intercalam entre ácidos nucleicos duplos e, portanto, mancham células em todos os estágios. No entanto, a quantidade de coloração de PI é proporcional à quantidade de DNA.

Embora a seleção de uma mancha dependa do experimento em questão, os pesquisadores muitas vezes usam procedimentos de coloração dupla. Moléculas como pi que se ligam proporcionalmente a todas as células podem facilmente diferenciar células G1 das células de fase G2 ou M. No entanto, as células de fase S ainda estão em transição. Portanto, a adição de moléculas como a BrdU que só rotulam células de fase S aumentam a especificidade da detecção do estágio de ciclo celular. Finalmente, as células são analisadas usando citometria de fluxo para enumerar células em diferentes estágios de ciclo celular.

Agora que você entende os princípios por trás da coloração do ciclo celular, vamos discutir um procedimento usando BrdU e PI.

Configure pratos de cultura celular: um para o experimento, e três adicionais como controles. Com cerca de 60% de confluência, a RU dissolvida nos meios culturais é adicionada às células vivas, seguida pela incubação. Nesta fase, brdU é incorporado dentro do DNA replicante.

Após a incubação, as células são centrifugadas e resuspengiadas em soro fisiológico tamponado de fosfato, ou PBS. Em seguida, as células são fixadas adicionando suspensão celular dropwise ao frio do gelo 70% etanol enquanto vórtices suavemente. Isso cessa a divisão celular e evita a aglomeração.

As células fixas são novamente centrifugadas e resuspendidas em PBS. Em seguida, uma solução de ácido concentrado contendo um detergente, como Triton-X, é adicionada às células dropwise. O detergente permeabiliza as células para permitir a entrada de compostos impermeáveis por membrana, e o ácido diminui o pH e denatura o DNA, expondo BrdU. As células são então centrifugadas, supernadante é descartada, e a pelota é resuspendida em solução alcalina para restaurar o pH.

Por fim, as células são lavadas com PBS e incubadas com um anticorpo BrdU conjugado a uma etiqueta fluorescente à temperatura ambiente. Após esta etapa, as amostras devem ser protegidas contra a luz para evitar fotobleaching.

Quando a coloração dupla, as células são incubadas com PI e RNase. RNase é necessário para remover fios duplos RNA-RNA ou RNA-DNA, que também se ligam ao PI e podem produzir resultados falsos positivos. As células são então passadas através de um coador de células para fazer uma suspensão celular única, o que é necessário para análise citométrica de fluxo.

Agora que você aprendeu o protocolo de coloração, vamos rever como analisar os dados obtidos.

Resumidamente, na citometria de fluxo um raio laser brilha em um fluxo estreito de suspensão de célula única, e a emissão em determinados comprimentos de onda dos corantes em cada célula é detectada como um único evento em um gráfico de dispersão.

Aqui, o lote de dispersão de células manchadas de PI mostram dois aglomerados distintos, um com quase o dobro da quantidade de PI do que o outro. Após a otimização do detector pi, esses conjuntos aparecem como dois picos em uma análise histograma. O pico em maior intensidade de PI representa células G2/M, e o de menor intensidade representa as células G1. As áreas sob esses picos representam o número de células nas fases correspondentes.

Da mesma forma, os eventos BrdU-FITC podem ser exibidos em uma análise histograma em uma escala logarítmica. Esta trama mostra que as células positivas de BrdU são distintamente mais brilhantes do que as células não manchadas, e como apenas uma fração da população está na fase S, um pico maior de células não manchadas de BrdU pode ser visto.

O gráfico de dispersão de células manchadas com BrdU e PI pode ser exibido com PI no eixo X linear e BrdU no eixo Y logarítmico, e isso mostra um padrão de ferradura indo de G1, S, para G2. A proporção de células nas áreas fechadas pode ser determinada e exibida em um gráfico de barras.

Agora que passamos pelo protocolo básico para análise de ciclo celular, vamos ver como ele pode ser usado em várias configurações experimentais.

Um. Ao combinar manipulações genéticas com a análise do ciclo celular, os cientistas estudam papéis de proteínas específicas na progressão do ciclo celular. Neste estudo, os cientistas superexpressaram uma proteína chamada p27 em fibroblastos embrionários de camundongos. Os resultados demonstram que a superexpressão levou a um menor número de células na fase S, indicando que essa proteína desempenha um papel crítico na regulação do ciclo celular.

Usando a análise do ciclo celular, os cientistas podem comparar cinética de progressão. Aqui, foram comparadas cinéticas de progressão entre duas linhas de células cancerígenas colorretais e uma linha celular contra o câncer de mama. Os resultados demonstraram que as células cancerígenas de mama progrediram através do ciclo celular a uma taxa mais lenta em comparação com as linhas celulares colorretais, dada a maior porcentagem de células cancerígenas de mama no G1 ao longo do tempo.

Por fim, para análise do ciclo de células in vivo, a BrdU pode ser injetada em roedores e a população celular alvo pode ser isolada para análise do ciclo celular. Neste estudo, as células-tronco hematopoiéticas ou HSCs de camundongos injetados por BrdU foram isoladas para análise citométrica de fluxo. Os dados coletados revelaram a distribuição de HSCs entre diferentes estágios de ciclo celular com predominância na fase G1 e S.

Você acabou de ver o vídeo do JoVE na análise do ciclo celular. Revisamos os princípios por trás desse processo, detalhamos um protocolo passo a passo e revisamos como esse tipo de análise é usada em várias configurações experimentais. Como sempre, obrigado por assistir!

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