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Il transwell migration assay

Overview

La migrazione delle cellule in risposta a segnali chimici è cruciale per lo sviluppo, l'immunità e gli stati patologici come il cancro. Per quantificare la migrazione cellulare, un semplice test è stato sviluppato nel 1961 dal Dr. Stephen Boyden, che ora è noto come il saggio di migrazione transwell o boyden chamber assay. Questo set-up consiste in un inserto che separa i pozzetti di una piastra multiwell in scomparti superiori e inferiori. Le cellule la cui migrazione deve essere studiata vengono seminate nel compartimento superiore e la soluzione chemioattrattante viene posizionata nel compartimento inferiore. Dopo l'incubazione, il conteggio delle cellule nel compartimento inferiore consente la quantificazione della migrazione indotta dai chemioattrattivi.

Questo video esaminerà il set-up sperimentale comunemente usato per gli studi sulla migrazione cellulare. Quindi evidenzieremo alcune considerazioni chiave e delineeremo un protocollo generalizzato per l'esecuzione di un esperimento che coinvolge cellule aderenti. Infine, esamineremo vari adattamenti di questa configurazione attualmente utilizzata per studiare diversi fattori che influenzano la migrazione.

Procedure

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Il test di migrazione transwell è una tecnica classica che consente agli scienziati di quantificare il movimento cellulare. La migrazione si riferisce alla capacità di una cella di spostarsi singolarmente o in cluster. I movimenti cellulari sono resi possibili attraverso una precisa ristrutturazione del loro citoscheletro e la migrazione di solito avviene in risposta a stimoli che fungono da segnali.

Oggi discuteremo il test di migrazione transwell, che utilizza una semplice configurazione della camera per valutare la migrazione in risposta ai segnali di attrazione.

Inizieremo fornendo alcune informazioni di base sulla camera transwell.

L'apparato è stato progettato per la prima volta dal Dr. Stephen Boyden nel 1961, che lo ha usato per studiare la migrazione dei leucociti. Pertanto, questo metodo è anche noto come test della camera di Boyden.

In una semplice camera di Boyden, la parete esterna è dei pozzi, come quelli di una piastra a 96 pozzi. All'interno di ogni pozzetto, viene posizionato un transwell, che è un inserto cilindrico. L'inserto ha una membrana in policarbonato di una dimensione dei pori definita. Quando viene posizionato nel pozzo, divide la camera in due scomparti. Il compartimento superiore è dove verranno seminate le cellule il cui comportamento migratorio deve essere studiato e il serbatoio inferiore è dove viene posizionata la soluzione di chemioattrattivo. Per definizione, un chemioattrattante è una molecola che ha la capacità di promuovere la motilità cellulare "attirando le cellule".

A causa di queste forze attrattive, le cellule nel compartimento superiore migrano attraverso i pori nel serbatoio inferiore. Se le cellule hanno proprietà aderenti, come alcune cellule di melanoma, dopo il movimento si "attaccheranno" alla parte inferiore della membrana. In questo caso, la membrana può essere fissata, macchiata e le cellule possono essere contate al microscopio. D'altra parte, le cellule non aderenti, come lo sperma, migreranno nel serbatoio inferiore. In questo caso, le cellule nella soluzione del serbatoio possono essere contate con l'aiuto di un emocitometro.

Sebbene la configurazione per questo test sia semplice, ci sono diverse cose che è necessario considerare prima dell'esperimento. Esaminiamo alcuni di loro.

A partire dalla soluzione di semina, è necessario assicurarsi che la densità sia ottimizzata per osservare la migrazione cellulare. Troppo poche cellule possono provocare una migrazione non rilevabile e densità maggiori sovrappopolano la membrana, rendendo difficile enumerare la migrazione. La seconda considerazione è la dimensione dei pori dell'inserto. Dovrebbe essere scelto con cura a seconda del tipo di cella. Se la dimensione dei pori è troppo piccola, le cellule non saranno in grado di passare.

In alternativa, se la dimensione dei pori è troppo grande, le cellule cadranno semplicemente, il che non è migrazione. Infine, bisogna essere consapevoli della concentrazione di chemioattrattari e del tempo di incubazione da tenere per la migrazione, poiché questi sono interdipendenti. La concentrazione ottimale con un tempo di incubazione appropriato durante il quale viene mantenuto il gradiente di concentrazione tra i compartimenti, induce la migrazione cellulare a causa della chemio-attrazione. Al contrario, le incubazioni prolungate possono essere accompagnate da un equilibrio di chemioattrattante in tutta la camera che porta alla perdita di gradiente chimico, che può confondere l'analisi dei risultati ottenuti.

Con queste considerazioni in mente, discutiamo di un protocollo utilizzato per misurare la migrazione delle cellule aderenti.

Le cellule da dosare sono preparate in un mezzo privo di proteasi, poiché le proteasi possono denaturare importanti recettori di membrana e, in ultima analisi, influenzare la migrazione. Dopo che le cellule sono state preparate, la sospensione deve essere diluita a una densità di semina ottimale. Per preparare la camera, i pozzetti trans sono posti in pozzetti su una piastra multiwell. La sospensione cellulare deve essere pipettata nel vano trans senza toccare la membrana o introdurre bolle d'aria.

La soluzione di chemioattante viene pipettata nel serbatoio inferiore, assicurandosi che la soluzione tocchi la membrana dell'inserto. Il tempo di incubazione per la migrazione dipenderà dalle considerazioni sperimentali. Dopo l'incubazione, le membrane vengono fissate immergendo l'inserto nel 70% di etanolo. Dopo aver permesso all'inserto di asciugarsi, viene aggiunta la soluzione di colorazione cellulare.

Successivamente, le cellule vengono incubate per circa 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, gli inserti vengono lavati con l'aiuto del tampone di lavaggio. Infine, la membrana può essere asportata e posizionata su un vetrino per microscopio. Le cellule sul lato inferiore della membrana rappresentano il numero di cellule che sono migrate in presenza e assenza di chemioattrattivi.

Dal momento che, ora hai un'idea del protocollo, diamo una breve occhiata a come i ricercatori stanno usando questo metodo nelle loro esplorazioni.

Una delle applicazioni più comuni di questo test è quella di valutare le proprietà chemioattrattarie di composti sconosciuti. Qui, gli scienziati erano interessati a esaminare i percorsi di nuoto degli spermatozoi di rana in presenza di allurina, che è una sostanza secreta dalle uova di anfibio. Per fare questo, hanno prima pipettato gli spermatozoi di rana attivi nella parte superiore degli inserti transwell. In fondo, hanno aggiunto allurina. Dopo aver permesso alle cellule di migrare, hanno contato gli spermatozoi nella soluzione del serbatoio al microscopio. Usando questa tecnica, sono stati in grado di generare una curva concentrazione-risposta che raffigura l'effetto della concentrazione di allurina sulla migrazione degli spermatozoi.

Quando una cellula viene attaccata da agenti patogeni, invia chemioattrattivi per reclutare cellule immunitarie che migrano, si attaccano e successivamente risolvono le infezioni. Per testare questo fenomeno, questi scienziati hanno coltivato cellule epiteliali sul lato inferiore degli inserti. Successivamente, hanno infettato queste cellule con diversi ceppi di batteri. Infine, hanno introdotto cellule immunitarie nella camera superiore. È noto che le cellule infette producono diversi chemioattrattivi che inducono la migrazione delle cellule immunitarie. I risultati di questo esperimento hanno dimostrato diversi gradi di migrazione dei neutrofili in risposta a diversi tipi di infezione batterica.

Infine, l'invasione delle cellule tumorali e le metastasi attraverso la matrice extracellulare hanno sempre incuriosito i biologi cellulari. Qui, gli scienziati volevano determinare come specifici chemioattrattivi possono contribuire a tale migrazione attraverso una matrice 3D. Hanno geneticamente modificato due pool separati di cellule: uno che esprime una proteina fluorescente verde e un'altra fluorescente rossa. Hanno quindi pipettato una matrice extracellulare mimica verso la parte superiore dei transwell.

Una volta solidificati, hanno invertito il transwell e seminato due pool di cellule nella parte inferiore della membrana. Successivamente, hanno sostituito l'inserto nella piastra multiwell e pipettato la soluzione chemioatttante nella camera superiore. Ciò ha causato lo spostamento delle celle nella parte inferiore verso l'alto e attraverso la matrice 3D. Con l'aiuto dell'imaging confocale, questi ricercatori hanno ricostruito la migrazione cellulare in 3D e hanno distinto i modelli di migrazione di due gruppi di cellule.

Hai appena visto il video di JoVE sul test di migrazione transwell. Con la comprensione dei componenti e del protocollo di questo metodo, ora sai perché è così ampiamente usato dai biologi cellulari. Nonostante la semplicità di questa configurazione, la gamma di configurazioni che questo metodo può adattare lo rende indispensabile per gli studi di motilità cellulare. Come sempre, grazie per aver guardato!

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