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Analisi di invasione mediante matrici 3D
 
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Analisi di invasione mediante matrici 3D

Overview

La matrice extracellulare (ECM) è una rete di molecole che forniscono un quadro strutturale per cellule e tessuti e aiutano a facilitare la comunicazione intercellulare. Sono state sviluppate tecniche di coltura cellulare tridimensionale per modellare in modo più accurato questo ambiente extracellulare per lo studio in vitro. Mentre molti processi cellulari durante la migrazione attraverso matrici 3D sono simili a quelli richiesti per il movimento su superfici 2D rigide, inclusa l'aderenza, la migrazione attraverso ECM richiede anche che le cellule modulano e invadano questa rete polimerica di ECM.

In questo video, presenteremo la struttura e la funzione dell'ECM e i meccanismi di base di come le cellule migrano attraverso di essa. Successivamente, esamineremo il protocollo di un test per la formazione di tubi da parte di cellule endoteliali, i cui passaggi possono essere generalizzati ad altri esperimenti basati su matrici 3D. Finiremo esplorando diverse altre domande biologiche che possono essere affrontate utilizzando i saggi di invasione ECM.

Procedure

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Gli scienziati hanno sviluppato modelli 3D per studiare con maggiore precisione i processi di invasione e migrazione cellulare. Mentre la maggior parte dei sistemi di coltura cellulare tradizionali sono 2D, le cellule nei nostri tessuti esistono all'interno di una rete 3D di molecole nota come matrice extracellulare o ECM. Mentre molti dei processi meccanicistici richiesti per la motilità cellulare in 2D e 3D sono simili, fattori come la ridotta rigidità dell'ECM rispetto alle superfici plastiche, l'aggiunta di una terza dimensione per la migrazione e l'ostacolo fisico di muoversi attraverso la rete di polimeri lunghi nell'ECM, presentano tutti sfide diverse per la cellula rispetto alla migrazione bidimensionale.

Questo video introdurrà brevemente la funzione e la struttura di base dell'ECM, nonché i meccanismi con cui le cellule modulano e migrano attraverso di esso. Successivamente, discuteremo un protocollo generale utilizzato per studiare l'invasione delle cellule endoteliali. Infine, evidenzieremo diverse applicazioni delle matrici 3D allo studio di diverse questioni biologiche.

Iniziamo esaminando la composizione dell'ECM e come le cellule interagiscono con esso.

L'ECM svolge molte funzioni, come fornire supporto alle cellule, facilitare la comunicazione intercellulare e separare i tessuti. La composizione dell'ECM varia tra i diversi tessuti e ha diverse proprietà biologiche, ma può essere classificata in due grandi tipi. La membrana basale serve ad ancorare e separare i tessuti, mentre la matrice interstiziale circonda e sostiene le cellule all'interno di un tessuto. La matrice interstiziale è composta principalmente dalla proteina fibrosa collagene, ma comprende anche elastina e fibronectina.

Diversi processi biologici devono verificarsi affinché le cellule migrino attraverso l'ECM. Il primo è l'adesione cellula-matrice, che coinvolge proteine transmembrana chiamate integrine. Questi collegano l'ECM all'impalcatura interna della cellula, nota come citoscheletro.

Un altro processo è il riarrangiamento strutturale del citoscheletro della cellula. Ciò porta alla formazione di strutture specializzate chiamate invadopodia, che sono sporgenze della cellula nella matrice circostante. Il passo finale è la modulazione ECM. Ciò coinvolge tipicamente molecole degradative note come metalloproteasi della matrice o MMP, che si accumulano nell'invadopodia e degradano l'ECM circostante, facilitando l'invasione cellulare. I saggi di invasione della matrice 3D consentono agli scienziati di visualizzare e studiare questo complesso processo.

Ora che hai familiarità con l'ECM e la sua interazione con le cellule, passiamo attraverso un protocollo per studiare l'invasione ECM da parte delle cellule endoteliali per formare tubuli. Coltivando cellule endoteliali in un ambiente 3D, si può simulare il processo biologico di crescita dei vasi sanguigni, noto anche come angiogenesi, che è importante sia durante lo sviluppo normale, sia per il cancro.

In primo luogo, le cellule endoteliali vengono coltivate e una sospensione a singola cellula viene preparata trattando le cellule con proteasi come la tripsina e facendole passare attraverso un filtro a rete per rompere i grumi cellulari. La matrice 3D, comunemente composta da collagene, fibrina, laminina o combinazioni più complesse di questi componenti, che possono essere preparate in laboratorio o ordinate da fornitori commerciali, viene quindi scongelata sul ghiaccio. Poiché la maggior parte dei preparati ECM polimerizza a temperature più elevate, è utile mantenere fredde anche altre apparecchiature e reagenti. La sospensione cellulare viene miscelata con la soluzione di matrice scongelata per incorporare le cellule e questa miscela viene collocata in un incubatore di colture cellulari dove la temperatura più elevata causerà la polimerizzazione della matrice.

Una volta impostata la matrice contenente cellule, i mezzi di coltura contenenti fattori angiogenici vengono aggiunti alla parabola della matrice. Utilizzando il software di microscopia time-lapse, le singole cellule possono quindi essere monitorate per osservare la loro migrazione attraverso la matrice. Le immagini risultanti vengono analizzate e le posizioni delle celle vengono utilizzate per calcolare la direzione del movimento e la distanza in micron. Questi valori possono quindi essere tracciati per determinare l'attività locomotoria, il tasso medio di migrazione delle cellule. Infine, la formazione della rete di tubi viene osservata e analizzata utilizzando un software di visualizzazione per identificare caratteristiche come nodi, tubi e loop.

Ora, esploriamo alcune applicazioni di matrici 3D in esperimenti specifici.

La migrazione cellulare è mediata dalla modulazione attiva del citoscheletro cellulare. In questo esperimento, le matrici di collagene sono state preparate e mescolate con una macchia contenente proteine fluorescenti rosse per consentire la visualizzazione. I singoli sferoidi cellulari, che sono cluster cellulari fluttuanti, sono stati isolati e incorporati nella matrice di collagene. Dopo l'incubazione, le cellule incorporate sono state colorate per specifici componenti citoscheletrici e riprese mediante microscopia a fluorescenza. I ricercatori hanno osservato componenti citoscheletrici e le loro alterazioni mentre le cellule migravano attraverso l'ECM.

Gli scienziati possono anche studiare come le proprietà dell'ECM influenzano la migrazione. Utilizzando un sistema di gel concentrico, in cui le cellule sono incorporate in una matrice di gel interna circondata da matrici esterne di concentrazioni variabili, gli scienziati possono tracciare le cellule usando la microscopia time-lapse per studiare la loro migrazione dal gel interno al gel esterno inizialmente privo di cellule. I ricercatori hanno osservato che la maggiore rigidità dei gel a concentrazione più elevata ha comportato un aumento sia dello spostamento cellulare che della distanza complessiva della migrazione cellulare.

Infine, i saggi di invasione della matrice possono essere eseguiti all'interno di un animale vivente per studiare l'angiogenesi in un contesto specifico dell'organo. Qui sono stati generati gel di fibrina, comunemente usati nell'ingegneria tissutale a causa della loro natura biodegradabile, seguiti dall'impianto nei polmoni dei topi dove i gel sono stati tenuti in posizione da una "colla" fatta della proteina fibrinogeno. La migrazione cellulare e la formazione di nuovi vasi sanguigni sono state lasciate accadere per i successivi 7-30 giorni, dopo di che i polmoni e i gel di fibrina sono stati raccolti, fissati e sezionati. L'imaging di queste sezioni ha rivelato la formazione di vasi sanguigni e alveoli nei gel impiantati, fornendo ai ricercatori informazioni su questo aspetto cruciale dello sviluppo polmonare nel suo ambiente in vivo.

Hai appena visto il video di JoVE sui saggi di invasione della matrice extracellulare. Questo video ha discusso la composizione dell'ECM e come le cellule migrano attraverso di esso, ha presentato un semplice protocollo per studiare la migrazione delle cellule endoteliali attraverso una matrice 3D e ha evidenziato diversi processi cellulari attualmente in fase di studio nel contesto delle interazioni cellula-ECM. Poiché la migrazione cellulare endogena avviene nello spazio 3D, queste condizioni biologiche sono meglio simulate con tecniche di coltura 3D. I miglioramenti nella composizione della matrice continueranno a consentire agli scienziati di replicare e studiare in modo più accurato la migrazione cellulare in laboratorio. Come sempre, grazie per aver guardato!

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