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3D 매트릭스를 사용한 침입 분석
 
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3D 매트릭스를 사용한 침입 분석

Overview

세포 외 매트릭스 (ECM)는 세포와 조직에 대한 구조적 프레임 워크를 제공하고 세포 간 통신을 용이하게하는 데 도움이되는 분자 네트워크입니다. 체외 연구를 위한 이 세포 외 환경을 보다 정확하게 모델링하기 위해 3차원 세포 배양 기술이 개발되었습니다. 3D 행렬을 통한 마이그레이션 하는 동안 많은 세포 프로세스는 고성 2D 표면을 가로 질러 이동에 필요한 것과 유사하지만, ECM을 통한 마이그레이션은 또한 ECM의 이 폴리머 메시를 조절하고 침수하는 세포가 필요합니다.

이 비디오에서는 ECM의 구조와 기능과 세포가 이를 통해 이동하는 방법의 기본 메커니즘을 제시할 것입니다. 그런 다음 내피 세포에 의한 튜브 형성에 대한 분석 의정서를 검사할 것이며, 3D 행렬을 기반으로 다른 실험으로 일반화할 수 있습니다. 우리는 ECM 침공 에세이를 사용하여 해결할 수있는 몇 가지 다른 생물학적 질문을 탐구하여 완료합니다.

Procedure

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과학자들은 세포 침입 및 이주 과정을 보다 정확하게 연구하기 위해 3D 모델을 개발했습니다. 대부분의 전통적인 세포 배양 시스템은 2D이지만, 우리의 조직에 있는 세포는 세포 외 매트릭스 또는 ECM로 알려져 있는 분자의 3D 네트워크 안에 존재합니다. 2D 및 3D의 세포 운동성에 필요한 많은 기계학적 과정이 유사하지만, 플라스틱 표면에 비해 ECM의 강성 감소, 이동을 위한 제3 차원의 추가, ECM내긴 폴리머의 메쉬를 통과하는 물리적 장애 등의 요인이 모두 2차원 이동에 비해 세포에 다른 과제를 제시한다.

이 비디오는 ECM의 기본 기능 및 구조뿐만 아니라 세포가 이를 통해 변조하고 이동하는 메커니즘을 간략하게 소개합니다. 다음으로, 내피 세포 침공을 연구하는 데 사용되는 일반적인 프로토콜에 대해 논의 할 것입니다. 마지막으로, 우리는 다른 생물학적 질문을 공부하기 위해 3D 행렬의 여러 응용 프로그램을 강조 할 것입니다.

먼저 ECM의 구성과 세포가 상호 작용하는 방식을 살펴보겠습니다.

ECM은 세포 지원 제공, 세포 간 통신 촉진 및 조직 분리와 같은 많은 기능을 수행합니다. ECM 조성은 다른 조직마다 다르며 생물학적 특성이 다르지만 두 가지 광범위한 유형으로 분류될 수 있다. 지하 멤브레인은 조직을 고정하고 분리하는 역할을하며, 중간 매트릭스는 조직 내의 세포를 둘러싸고 지원합니다. 간질 매트릭스는 주로 섬유성 단백질 콜라겐으로 구성되지만 엘라스틴과 섬유넥틴도 포함합니다.

세포가 ECM을 통해 마이그레이션하기 위해서는 여러 가지 생물학적 과정이 발생해야 합니다. 첫 번째는 세포 매트릭스 접착력으로, 이는 통합이라고 불리는 막 이상 단백질을 수반합니다. 이들은 세포 골격으로 알려져 있는 세포의 내부 발판에 ECM을 연결합니다.

또 다른 과정은 세포의 세포 골격의 구조적 재배열입니다. 이것은 그것의 주변 매트릭스로 세포의 돌출인 invadopodia에게 불린 특수한 구조물의 형성으로 이끌어 냅니다. 마지막 단계는 ECM 변조입니다. 이것은 전형적으로 매트릭스 금속로테아제 또는 MmPs로 알려져 있는 열화 분자를 관련시킵니다, 이는 침략에 축적되고 주변 ECM을 저하시키는, 세포 침략을 촉진합니다. 3D 매트릭스 침입 assays는 과학자들이 이 복잡한 과정을 시각화하고 연구할 수 있게 합니다.

이제 ECM과 세포와의 상호 작용에 익숙해지면 내피 세포에 의한 ECM 침공을 연구하여 튜블러를 형성하기 위한 프로토콜을 살펴보겠습니다. 3D 환경에서 내피 세포를 배양함으로써, 정상적인 발달과 암 모두에서 중요한 혈관 신생이라고도 하는 혈관 성장의 생물학적 과정을 시뮬레이션할 수 있습니다.

먼저, 내피 세포는 배양되고, 단일 세포 현탁액은 트립신과 같은 프로테아제로 세포를 치료하고, 세포 덩어리를 분해하기 위해 메쉬 필터를 통과시킴으로써 제조된다. 일반적으로 콜라겐, 피브린, 라미닌 또는 이러한 구성 요소의 더 복잡한 조합으로 구성된 3D 매트릭스는 실험실에서 준비하거나 상업 벤더에서 주문할 수 있으며 얼음 위에 해동됩니다. 대부분의 ECM 제제는 더 높은 온도에서 중합되기 때문에 다른 장비와 시약도 차갑게 유지하는 것이 도움이됩니다. 세포 현탁액은 세포를 포함시키는 해동 매트릭스 용액과 혼합되며, 이 혼합물은 더 높은 온도로 매트릭스가 중합되는 세포 배양 인큐베이터로 배치된다.

세포 함유 매트릭스가 설정되면 혈관신생 인자를 포함하는 배양 배지가 매트릭스 접시에 추가됩니다. 시간 경과 현미경 소프트웨어를 사용하여 개별 셀을 추적하여 행렬을 통해 마이그레이션을 관찰할 수 있습니다. 결과 이미지를 분석하고 셀 위치는 미크론에서 이동 방향과 거리를 계산하는 데 사용됩니다. 그런 다음 이러한 값을 플롯하여 세포의 평균 이동률인 운동 활성을 결정할 수 있습니다. 마지막으로, 튜브 네트워크 형성은 시각화 소프트웨어를 사용하여 관찰 및 분석하여 노드, 튜브 및 루프와 같은 기능을 식별합니다.

이제 특정 실험에서 3D 행렬의 몇 가지 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.

세포 이동은 세포 세포 골격의 활성 변조에 의해 매개된다. 본 실험에서 콜라겐 매트릭스는 적색 형광 단백질을 함유한 얼룩과 함께 제조및 혼합하여 시각화를 가능하게 하였다. 자유 부동 세포 클러스터인 개별 세포 스페로이드는 콜라겐 매트릭스에 분리되고 내장되었다. 배양 후, 임베디드 세포는 특정 사이토셀레탈 성분을 위해 염색되었고, 형광 현미경검사법에 의해 심화되었다. 연구원은 세포가 ECM을 통해 마이그레이션으로 세포 켈레탈 구성 요소와 그들의 변경을 관찰했습니다.

과학자들은 또한 ECM의 특성이 마이그레이션에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 세포가 다양한 농도의 외부 행렬로 둘러싸인 내부 젤 매트릭스에 내장되어 있는 동심 겔 시스템을 사용하여 과학자들은 시간 경과 현미경 을 사용하여 세포를 추적하여 내부 젤에서 초기 세포없는 외부 젤로의 이주를 연구할 수 있습니다. 연구원은 더 높은 농도 젤의 더 큰 강성 세포 변위와 세포 이동의 전반적인 거리에서 증가 귀착되었다는 것을 관찰했습니다.

마지막으로, 매트릭스 침입 분석은 장기 특정 맥락에서 혈관 신생을 연구하기 위해 살아있는 동물 내에서 수행 될 수있다. 여기서, 피브린 젤은 생분해성 특성으로 인해 조직 공학에 일반적으로 사용되었으며, 그 다음에 단백질 피브리노겐으로 만든 "접착제"에 의해 젤이 제자리에 붙이는 마우스 폐로 이식하여 생성되었습니다. 세포 이동 및 새로운 혈관 형성은 폐와 피브린 젤을 수확, 고정 및 절제한 후 7~30일 동안 발생할 수 있었다. 이 단면도의 화상 진찰은 이식한 젤에 있는 혈관 그리고 폐포 형성을 제시했습니다, 연구원에게 그것의 생체 내 조정에 있는 폐 발달의 이 중요한 양상에 통찰력을 주는.

세포외 매트릭스 침공 에세이에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 이 비디오는 ECM의 구성과 세포가 그것을 통해 이동하는 방법에 대해 논의하고, 3D 매트릭스를 통해 내피 세포 이동을 연구하는 간단한 프로토콜을 제시하고, 현재 세포-ECM 상호 작용의 맥락에서 연구되고있는 여러 세포 프로세스를 강조했다. 내인성 세포 이동은 3D 공간에서 발생하기 때문에 이러한 생물학적 조건은 3D 배양 기술에 의해 가장 잘 시뮬레이션됩니다. 매트릭스 구성의 개선은 과학자들이 실험실에서 세포 이동을 보다 정확하게 복제하고 연구할 수 있도록 계속 할 것입니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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