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Ensaio de invasão usando matrizes 3D
 
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Ensaio de invasão usando matrizes 3D

Overview

A matriz extracelular (ECM) é uma rede de moléculas que fornecem uma estrutura estrutural para células e tecidos e ajuda a facilitar a comunicação intercelular. Técnicas tridimensionais de cultura celular foram desenvolvidas para modelar com mais precisão este ambiente extracelular para estudo in vitro. Embora muitos processos celulares durante a migração através de matrizes 3D sejam semelhantes aos necessários para o movimento em superfícies rígidas 2D, incluindo a adesão através do ECM também requer células para modular e invadir esta malha polimérica de ECM.

Neste vídeo, apresentaremos a estrutura e função do ECM e os mecanismos básicos de como as células migram através dele. Em seguida, examinaremos o protocolo de um ensaio para a formação de tubos por células endoteliais, cujos passos podem ser generalizados para outros experimentos baseados em matrizes 3D. Terminaremos explorando várias outras questões biológicas que podem ser abordadas usando ensaios de invasão do ECM.

Procedure

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Cientistas desenvolveram modelos 3D para estudar com mais precisão os processos de invasão e migração celular. Enquanto a maioria dos sistemas tradicionais de cultura celular são 2D, as células em nossos tecidos existem dentro de uma rede 3D de moléculas conhecidas como matriz extracelular ou ECM. Embora muitos dos processos mecanicistas necessários para a motilidade celular em 2D e 3D sejam semelhantes, fatores como a rigidez reduzida do ECM em comparação com superfícies plásticas, a adição de uma terceira dimensão para a migração e o obstáculo físico de se mover através da malha de polímeros longos no ECM, todos apresentam diferentes desafios à célula em comparação com a migração bidimensional.

Este vídeo introduzirá brevemente a função básica e a estrutura do ECM, bem como os mecanismos pelos quais as células modulam e migram através dele. Em seguida, discutiremos um protocolo geral usado para estudar a invasão de células endoteliais. Por fim, destacaremos várias aplicações de matrizes 3D para o estudo de diferentes questões biológicas.

Vamos começar examinando a composição do ECM, e como as células interagem com ele.

O ECM desempenha muitas funções, como fornecer suporte para as células, facilitar a comunicação intercelular e separar tecidos. A composição do ECM varia entre diferentes tecidos e possui diferentes propriedades biológicas, mas pode ser classificada em dois tipos amplos. A membrana do porão serve para ancorar e separar tecidos, enquanto a matriz intersticial envolve e suporta as células dentro de um tecido. A matriz intersticiais é composta principalmente pelo colágeno de proteína fibrosa, mas também inclui elastina e fibronectina.

Vários processos biológicos precisam ocorrer para que as células migrem através do ECM. A primeira é a adesão à matriz celular, que envolve proteínas transmembranas chamadas integrins. Estes ligam o ECM ao andaime interno da célula, conhecido como citoesqueleto.

Outro processo é o rearranjo estrutural do citoesqueleto da célula. Isso leva à formação de estruturas especializadas chamadas invadopodia, que são saliências da célula em sua matriz circundante. O passo final é a modulação do ECM. Isso normalmente envolve moléculas degradativas conhecidas como metaloproteases matricial ou MMPs, que se acumulam na invadopodia e degradam o ECM circundante, facilitando a invasão celular. Ensaios de invasão de matriz 3D permitem que os cientistas visualizem e estudem esse processo complexo.

Agora que você está familiarizado com o ECM e sua interação com as células, vamos passar por um protocolo para estudar a invasão do ECM por células endoteliais para formar túbulos. Ao cultivar células endoteliais em um ambiente 3D, pode-se simular o processo biológico de crescimento dos vasos sanguíneos, também conhecido como angiogênese, que é importante durante o desenvolvimento normal, bem como o câncer.

Primeiro, as células endoteliais são cultivadas, e uma única suspensão celular é preparada tratando as células com proteases como trippsina, e passando-as através de um filtro de malha para quebrar aglomerados celulares. A matriz 3D, comumente composta de colágeno, fibrina, laminina ou combinações mais complexas desses componentes — que podem ser preparados em laboratório ou encomendados de fornecedores comerciais — é então descongelada no gelo. Como a maioria dos preparações de ECM polimerizam em temperaturas mais altas, é útil manter outros equipamentos e reagentes frios também. A suspensão celular é misturada com a solução matricial descongelada para incorporar células, e essa mistura é colocada em uma incubadora de cultura celular onde a temperatura mais alta fará com que a matriz se polimerize.

Uma vez definida a matriz contendo células, a mídia cultural contendo fatores angiogênicos é adicionada ao prato de matriz. Usando o software de microscopia de lapso de tempo, as células individuais podem então ser rastreadas para observar sua migração através da matriz. As imagens resultantes são analisadas, e as posições das células são usadas para calcular a direção de movimento e a distância em mícrons. Esses valores podem então ser plotados para determinar a atividade locomotória — a taxa média de migração das células. Finalmente, a formação da rede de tubos é observada e analisada usando software de visualização para identificar recursos como nódulos, tubos e loops.

Agora, vamos explorar algumas aplicações de matrizes 3D em experimentos específicos.

A migração celular é mediada pela modulação ativa do citoesqueleto celular. Neste experimento, as matrizes de colágeno foram preparadas e misturadas com uma mancha contendo proteína fluorescente vermelha para permitir a visualização. Esferoides de células individuais, que são aglomerados de células flutuantes livres, foram isolados e incorporados na matriz de colágeno. Após a incubação, as células incorporadas foram manchadas para componentes citoesqueléticos específicos e imagens por microscopia de fluorescência. Os pesquisadores observaram componentes citoesqueléticos e suas alterações à medida que as células migravam através do ECM.

Os cientistas também podem estudar como as propriedades do ECM afetam a migração. Usando um sistema de gel concêntrico, onde as células estão embutidas em uma matriz de gel interior cercada por matrizes externas de concentrações variadas, os cientistas podem rastrear células usando microscopia de lapso de tempo para estudar sua migração do gel interno para o gel externo inicialmente livre de células. Os pesquisadores observaram que a maior rigidez dos géis de maior concentração resultou em aumentos tanto no deslocamento celular quanto na distância geral da migração celular.

Finalmente, ensaios de invasão matricial podem ser realizados dentro de um animal vivo para estudar angiogênese em um contexto específico de órgãos. Aqui, géis de fibrina — comumente usados na engenharia de tecidos devido à sua natureza biodegradável — foram gerados, seguidos pela implantação em pulmões de camundongos onde os géis eram mantidos no lugar por uma "cola" feita do fibrinogênio proteico. A migração celular e a formação de novos vasos sanguíneos foram permitidas nos seguintes 7 a 30 dias, após os quais os pulmões e géis fibrinas foram colhidos, fixos e seccionados. Imagens dessas seções revelaram a formação de vasos sanguíneos e alvéolos nos géis implantados, dando aos pesquisadores uma visão sobre esse aspecto crucial do desenvolvimento pulmonar em seu cenário in vivo.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre ensaios de invasão de matriz extracelular. Este vídeo discutiu a composição do ECM e como as células migram através dele, apresentou um protocolo simples para estudar a migração celular endotelial através de uma matriz 3D, e destacou vários processos celulares atualmente sendo estudados no contexto das interações célula-ECM. Como a migração de células endógenas ocorre no espaço 3D, essas condições biológicas são melhor simuladas por técnicas de cultura 3D. Melhorias na composição matricial continuarão a permitir que os cientistas repliquem com mais precisão e estudem a migração celular em laboratório. Como sempre, obrigado por assistir!

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