Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Cell Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

Un'introduzione all'endocitosi e all'esocitosi
 
Click here for the English version

Un'introduzione all'endocitosi e all'esocitosi

Overview

Le cellule possono assumere sostanze dall'ambiente extracellulare mediante endocitosi e rilasciare attivamente molecole in esso mediante esocitosi. Tali processi coinvolgono sacche legate alla membrana lipidica chiamate vescicole. La conoscenza dell'architettura molecolare e dei meccanismi di entrambi è la chiave per comprendere la normale fisiologia cellulare, così come gli stati patologici che sorgono quando diventano difettosi.

Questo video esaminerà prima brevemente alcune scoperte fondamentali nella storia della ricerca sull'endo- e l'esocitosi. Successivamente, verranno esaminate alcune domande chiave, seguite da una discussione sui metodi di spicco utilizzati per indagare su questi problemi, tra cui l'etichettatura cellulare, i saggi di fusione e l'imaging a fluorescenza. Infine, esplorerà le attuali ricerche condotte oggi dagli scienziati del settore.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Le vie endocitiche ed esocitiche sono fondamentali per l'omeostasi cellulare, la funzione tissutale e la sopravvivenza cellulare globale. In poche parole, l'endocitosi è il processo che una cellula utilizza per prendere molecole dallo spazio extracellulare piegando la sua membrana attorno ad essa e formando una vescicola. L'esocitosi è il processo inverso, che utilizza le vescicole per rilasciare sostanze nello spazio extracellulare. Questi processi sono stati suggeriti per svolgere un ruolo critico nella secrezione ormonale, nell'internalizzazione del recettore di membrana, nell'inghiottimento di agenti patogeni e nelle comunicazioni neuronali.

Oggi ripercorreremo alcune delle scoperte di riferimento nel campo dell'endocitosi e dell'esocitosi, evidenzieremo alcune delle domande senza risposta, presenteremo metodi notevoli che vengono utilizzati oggi e, infine, esploreremo alcuni esperimenti specifici eseguiti per comprendere meglio questi processi.

Rivisitiamo alcune delle scoperte epocali che hanno portato all'attuale comprensione dell'endocitosi e dell'esocitosi.

La prima documentazione relativa all'endocitosi può essere mappata al 1882, quando Ilya Metchnikov, usando un microscopio ottico, osservò che cellule specifiche inghiottivano agenti patogeni invasori. Ha chiamato questo processo "fagocitosi", in cui le cellule inghiottono l'agente patogeno attraverso la formazione di vescicole. Quasi mezzo secolo dopo, nel 1931, Warren Lewis osservò un simile processo di formazione di vescicole quando le cellule assumevano liquido. Ha chiamato questo comportamento "pinocitosi".

Più tardi, nel 1953, George Palade, mentre esaminava l'organizzazione strutturale e funzionale della cellula, scoprì invaginazioni "caverniche" delle membrane e le chiamò caveole. Ha dedotto che questi devono essere necessari per l'assunzione di cellule. Poco dopo, nel 1955, il premio Nobel Christian de Duve coniò il termine endocitosi, che comprendeva "fagocitosi" e "pinocitosi". Tuttavia, la storia dell'endocitosi non era ancora finita.

Nel 1975, Michael Brown e Joseph Goldstein, con l'esperto di microscopia elettronica Richard Anderson, osservarono che quando la lipoproteina a bassa densità, o LDL, si lega al suo recettore di superficie cellulare, porta alla formazione di "fosse rivestite". Queste fosse vengono quindi internalizzate e i recettori LDL endocitosi. Questa è stata la scoperta del terzo tipo, chiamato "endocitosi mediata dal recettore". Nello stesso anno, Barbara Pearse isolò la principale proteina del mantello, una molecola di triskelion, e la chiamò clatrina. Pertanto, questo processo è anche chiamato "endocitosi mediata dalla clatrina".

Questo riguardava l'endocitosi. Ora discutiamo di come abbiamo imparato a conoscere l'esocitosi. Nel 1980, il gruppo di Randy Schekman generò mutanti di lievito che erano carenti di secrezione e rivelò la presenza di geni critici che codificavano per le proteine necessarie per l'esocitosi.

Nel 1993, James Rothman identificò alcune di queste proteine e, in base alla loro natura chimica, furono chiamate SNARE. Nella sua seminale "ipotesi SNARE", ha proposto che queste strutture elicoidali si aggancino l'una all'altra, facendo sì che le membrane si avvicinino con una forza sufficiente per fondersi e generare esocitosi.

Più o meno nello stesso periodo, Thomas Südhof stabilì che questo processo era anche strettamente controllato nei neuroni da proteine sensibili al calcio chiamate sinaptotagmine che favorivano e cronostazionano accuratamente la fusione delle vescicole per il rilascio di neurotrasmettitori. Insieme, questi scienziati hanno ricevuto il premio Nobel nel 2013.

Nonostante l'ampiezza di queste scoperte, rimangono molti enigmi intriganti. Diamo un'occhiata ad alcune delle domande esplorate oggi.

Gli scienziati stanno iniziando a chiedersi come le funzioni dell'endocitosi e dell'esocitosi vadano oltre l'acquisizione e la secrezione di sostanze. Ad esempio, in che modo i neurotrasmettitori vengono continuamente rilasciati dalle vescicole che si fondono alla membrana cellulare senza una catastrofica espansione delle dimensioni delle cellule? Stanno cercando di identificare i segnali che inducono le cellule a internalizzare la membrana, al fine di compensare l'espansione e riciclare le risorse.

Un altro argomento interessante è: quali componenti compongono il sofisticato macchinario molecolare che guida questi processi? Ad esempio, la fagocitosi richiede grandi deformazioni della membrana per circondare gli agenti patogeni invasori. Gli scienziati stanno studiando come le proteine citoscheletriche come l'actina contribuiscono al drammatico rimodellamento della membrana.

Infine, poiché l'endocitosi aberrante e l'esocitosi possono causare gravi malattie, gli scienziati sono interessati a capire cosa causa questa disregolazione. Una delle proteine esaminate è la α-sinucleina, la cui secrezione dai neuroni è stata implicata nella morte progressiva dei neuroni vicini. Comprendere la sua esocitosi potrebbe fornire preziose informazioni sul trattamento delle malattie neurodegenerative come il Parkinson.

Ora che abbiamo considerato alcune delle domande chiave oggetto di indagine, vediamo quali strumenti sono disponibili per rispondere.

I ricercatori utilizzano un test di biotinilazione cellulare per tracciare l'endocitosi delle proteine di superficie cellulare. Questo processo comporta l'etichettatura di una proteina di superficie con biotina marcata fluorescentemente e quindi consente alla cellula di sottoporsi a endocitosi. Questo può essere seguito da un'analisi immunitaria, rivelando l'internalizzazione delle proteine.

Al fine di quantificare il riciclaggio delle vescicole neuronali, molti scienziati etichettano le cellule con molecole fluorescenti specifiche della membrana, come i coloranti FM. Questi coloranti si legano stabilmente al foglietto esterno e sono interiorizzati solo dall'endocitosi. Dopo la stimolazione sequenziale, vengono esocitosi. L'analisi del rilascio con un microscopio a fluorescenza consente una visione più approfondita dell'intero processo di riciclaggio.

Spesso, per manipolare e comprendere i contributi dei componenti che consentono l'esocitosi, gli scienziati impostano saggi di fusione. Due serie di vescicole con un contenuto di colorante fluorescente distinto vengono preparate e lasciate insieme. La fusione tra loro si traduce nella formazione di un nuovo prodotto, che può essere monitorato utilizzando un lettore di micropiasse.

Infine, sofisticati metodi di imaging, tra cui l'imaging a fluorescenza e l'imaging di cellule vive a fluorescenza, presentano ai ricercatori l'opportunità unica di immaginare strutture morfologiche ed eventi molecolari di endocitosi ed esocitosi.

Infine, diamo un'occhiata ad alcuni modi specifici in cui gli scienziati stanno implementando questi strumenti nei laboratori di oggi.

I biologi cellulari sono interessati a studiare come l'esocitosi aiuta a guarire le membrane danneggiate. Qui, i ricercatori hanno prima ferito le cellule in soluzione di coloranti FM facendo rotolare le perle di vetro su di esse. La successiva imaging a fluorescenza mostra che se il tasso di esocitosi è veloce, sigillerà rapidamente la membrana e impedirà alla FM di fuoriuscire nella cellula. Quando l'esocitosi è lenta, si traduce in un'estesa colorazione FM intracellulare.

I ricercatori possono utilizzare saggi di fusione per modellare il contributo di specifiche proteine di fusione. Qui, i ricercatori hanno espresso diverse proteine di membrana associate alle vescicole o "VAMP", che sono proteine SNARE, sulla superficie di due pool di cellule. La fusione è stata quindi autorizzata a svolgersi e il risultato è stato quantificato utilizzando uno spettrometro. Utilizzando questa configurazione, gli scienziati sono stati in grado di confrontare le efficienze di fusione di più VAMP.

Infine, i ricercatori mirano a comprendere l'endocitosi del recettore della superficie cellulare in risposta a un farmaco. Qui, gli scienziati hanno trattato le cellule marcate fluorescentemente con un farmaco e hanno visualizzato l'endocitosi medicata dal recettore che si verifica in tempo reale utilizzando la microscopia time-lapse.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'endocitosi e all'esocitosi. In questo video, abbiamo esaminato i punti salienti storici a partire dalla scoperta della fagocitosi fino alla definizione dei meccanismi di rilascio dei neurotrasmettitori. Successivamente, abbiamo introdotto alcune domande chiave poste. Abbiamo anche esplorato importanti strategie di ricerca e discusso alcune delle loro attuali applicazioni. Come sempre, grazie per aver guardato!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter