Overview
セルがどのセル表面蛋白質は細胞質に効果的に隔離、次のエンドサイトーシスによって細胞膜上の特定蛋白質の量を調整できます。一度セル内これらの表面のタンパク質が破壊したり、膜に戻って「リサイクル」。細胞表面ビオチン化分析は、研究者がこれらの現象を研究することを提供します。技術表面タンパク質をラベルすることができますし、化学的に切断され、小分子のビオチンの誘導体を使用します。ただし、表面のタンパク質は、貪食は、胸の谷間からビオチン誘導体が保護されます。したがって、分解されていない、貪食ビオチン ラベルを分析して科学者は内面の表面タンパク質の量を評価できます。
このビデオではビオチン誘導体の化学構造とその胸の谷間のメカニズムに踏み込んでビオチン化アッセイの背後にある概念を確認します。これは、技術の一般化されたプロトコルと最後に、どのように研究者現在使用して異なるセル表面蛋白質のダイナミクスを調べるための説明が続きます。
Procedure
ビオチンと細胞表面タンパク質の膜タンパク質に関与する細胞輸送経路を研究するための強力なツールが表示されます。セルは、表面の蛋白質の堅く調整されたセットを維持それを受信でき、いくつかのシグナル伝達経路を介して細胞外の情報に対応します。自分の内面を引き起こすことによってこれらの細胞の表面蛋白質の調節に関与するエンドサイトーシス、巻き込む、過程が示唆されました。したがって、ビオチンに役立ちます彼らの内面を定量化し、細胞経路の役割の研究は科学者のようなエージェントと貪食される前にこれらの蛋白質の分類。
このビデオで原則と細胞表面ビオチン化試金の方法論を取り上げ、このメソッドを今日科学者に対応、いくつかの方法を探る。
細胞表面ビオチン化アッセイ原理をまず確認してみましょう。
前述したように、細胞はエンドサイトーシス経路を使用して時空間密度と表面タンパク質の分布を調整します。内面化されたタンパク質は次の劣化、リソソームにシャントまたは継続的な活動のための細胞の表面に戻ってリサイクルにできる特定の細胞経路を通じて転送されます。細胞表面ビオチン化は、これらのプロセスを測定するために設計されています。
この試金で使用される札ビオチン-ビタミン H とも呼ばれる-小さい、水溶性の分子であります。ビオチンは表面の分類の実験のための一般的に使用される誘導体はスルホ-NHS-SS-ビオチン、スルホ N-ヒドロキシ スクシンイミド エステル グループ、ジスルフィド結合、もちろんビオチンから成っています。ビオチンを"b"に置き換えることでこの巨大な構造を簡素化しましょう
この構造でスルホ ビオチン膜のこの形態は非透過性、強い電荷を与えます。セル表面蛋白質の分類は、スルホ-NHS-SS-ビオチンをエンドサイトーシスに制限の厳しい温度で維持されるセルに追加することによって行われます。NHS のグループは、共有結合を形成表面蛋白質の第一級アミンと反応します。
その後、標識細胞はエンドサイトーシス、その中にいくつか分類された蛋白質の内在化に寛容な温度に移動されます。最後に、細胞はエンドサイトーシスを停止に戻って制限温度に移動されます。具体的に内面化された蛋白質を親水性、膜非透過性の還元剤を定量化するために、L-グルタチオンのような-が追加されます。Unendocytosed スルホ NHS SS ビオチン、ジスルフィド結合と反応、オフ ビオチンのグループを切断します。この時点で残りのビオチン化タンパク質は、彼らが以前に内面化されたのでラベルを持つが還元剤から保護されました。
細胞が分離し、貪食ビオチン化タンパク質を定量化する分離。分離は、通常セル lysates をストレプトアビジン コーティング合成ビーズに追加することによって実行されます。ストレプトアビジンはビオチンの親和性が非常に高いため、ビオチン化タンパク質はコーティングを施したビーズに自分自身を添付します。洗浄汚染タンパク質を削除する手順と最後に溶出のステップのシリーズを実行して、バインドされた蛋白質を解放します。ターゲット蛋白質は、西部にしみが付くことのような技術によって分析できます。
以来、ビオチン化アッセイの背後にある概念を知っている今表面蛋白質のエンドサイトーシスを測定するこの手順を実行する方法を示す一般的なプロトコルを見てみましょう。
培養細胞の 4 ° C に冷却開始します。エンドサイトーシスに制限の厳しい温度を維持するために氷の上に置きます。次に、膜の不浸透性スルホ-NHS-SS-ビオチン試薬が追加され、約 30 分間、暗闇の中で孵化する細胞。これはビオチン ラベル表面タンパク質に共有結合を付けるのに十分な時間をことができます。セルは氷から削除し、37 ° C で 30 分インキュベートします。この温度では、ビオチン化表面蛋白質は貪食です。次の孵化、セル、4 ° C に冷却、L-グルタチオンのような親水性の還元剤が追加されます。これはジスルフィド結合と反応し、ラベル、unendocytosed 蛋白質からビオチン グループを解放します。
次に、セルが服従遠心分離、従って細胞膜を壊すとビオチン化タンパク質を公開することによって分離します。次に、溶解液、ストレプトアビジン コーティング ビーズに追加され、ビオチン化タンパク質をバインドできます。ビーズに洗われて、冷たいリン酸緩衝生理食塩水や溶出洗剤と還元剤を含むバッファー。これらの試薬はビーズをバインドされた蛋白質を変化、溶出液の回復を有効にします。溶出液中のタンパク質は、その分子の質量に基づくゲル電気泳動で区切られます。最後に、西部のしみが付くことおよび蛋白質特定の抗体としみのプロービングは、標的タンパク質の可視化を許可します。結果バンド密度から割合貪食タンパク質を定量化することができます。
今ではセルのビオチン化の方法論を理解すると、実験に使用する方法を見てみましょう。
このビオチン化プロトコルの最も一般的なアプリケーションは、特定のセル表面蛋白質のエンドサイトーシスの率を測定することです。ここでは、科学者はドーパミントランスポーターあるいは DAT の内面化の評価に興味があった標準的なプロトコルに従うことによって科学者は、貪食 DATs の割合を測定することができた.これは代表的なイムノブロット表示レーン T、「内面」蛋白質の結果を表す内面、S は「削除」のサンプル細胞が決してエンドサイトーシスを続行する許可が還元剤と車線レーンの前に蛋白質の「合計」の量に対応します。
表面蛋白質のエンドサイトーシスを測るだけ、に加えて、科学者はまたこのプロセスに及ぼす薬を調査します。本研究では、研究者は、活性化プロテインキナーゼ C (PKC)、そのアクションが DAT の内在化を誘導するために示唆されていると治療への反応で DATs の表面密度を評価しました。科学者はマウスの脳組織のex vivoアッセイに使用する生体外でビオチン化プロトコルを適応させることによってこれを確認しました。明らかにしたデータは DAT の PKC の活性化に対して、細胞膜から約 30% の損失。
最後に、ビオチン化アッセイを調整でも測定できる膜タンパク質のリサイクルします。ここでは、研究者は、表面チャネル蛋白質、CFTR、塩化物イオンを実施するための責任を調査していました。リサイクルを評価するために研究者は、セルの 1 つのグループの標準的なビオチン化プロトコルを実行し、unendocytosed 表面タンパク質のビオチンを割断後のステップを追加することによって細胞の 2 番目のグループのためのプロトコルを変更します。温度を上げ含まれている追加の手順は、内面のいくつかのリサイクルするための 37 ° c、ビオチン付けられた受容体蛋白質。内面化された蛋白質リサイクルが行われる前後の違いを計算することにより、これらの科学者パーセント CFTR 膜に戻ってリサイクルを定量化することができた。
あなたはちょうど細胞表面ビオチン化アッセイにゼウスの導入を見た。ビデオは、このアッセイの手続きの手順を説明、各ステップで発生する反応を説明しました。最後に、私たちは、この法の適用性を示したいくつかの例の実験を調査しました。いつも見てくれてありがとう!
