Overview
Uma célula pode regular a quantidade de proteínas particulares em sua membrana celular através da endocitose, seguindo quais proteínas da superfície celular são efetivamente sequestradas no citoplasma. Uma vez dentro de uma célula, essas proteínas superficiais podem ser destruídas ou "recicladas" de volta à membrana. O ensaio de biotintilação da superfície celular fornece aos pesquisadores uma maneira de estudar esses fenômenos. A técnica faz uso de um derivado da biotina de molécula pequena, que pode rotular proteínas superficiais e, em seguida, ser quimicamente cortado. No entanto, se a proteína superficial for endocitada, a derivada de biotina será protegida do decote. Assim, analisando o rótulo de biotina endocitosa, os cientistas podem avaliar as quantidades de proteínas superficiais internalizadas.
Neste vídeo, revisamos os conceitos por trás do ensaio de biotintilação, aprofundando-se na estrutura química do derivado biotina e no mecanismo de seu decote. Isso é seguido por um protocolo generalizado da técnica e, finalmente, uma descrição de como os pesquisadores atualmente a estão usando para estudar a dinâmica de diferentes proteínas da superfície celular.
Procedure
A rotulagem de proteínas de superfície celular com biotina apresenta uma poderosa ferramenta para estudar as vias de transporte celular envolvidas na regulação de proteínas de membrana. Uma célula mantém um conjunto bem regulado de proteínas na superfície, para que possa receber e responder a informações extracelulares através de várias vias de sinalização. Sugere-se que a endocitose, um processo de engolfação, esteja envolvida na regulação dessas proteínas da superfície celular, causando sua internalização. Portanto, rotular essas proteínas antes de serem endócitos com agentes como a biotina ajuda os cientistas a quantificar sua internalização e estudar seus papéis em vias celulares.
Neste vídeo, discutiremos os princípios e a metodologia dos ensaios de biotintilação da superfície celular e exploraremos algumas maneiras pelas quais os cientistas estão adaptando esse método hoje.
Vamos primeiro rever os princípios por trás do ensaio de biotintilação da superfície celular.
Como mencionado anteriormente, as células utilizam vias endocíticas para regular a densidade espostetemporal e a distribuição de proteínas superficiais. As proteínas internalizadas são transportadas através de vias celulares específicas, seguindo as quais podem ser desviadas para o lysosome para degradação, ou recicladas de volta à superfície celular para atividade contínua. A biotintilação da superfície celular foi projetada para medir esses processos.
A etiqueta usada neste ensaio, biotina — também conhecida como vitamina H — é uma pequena molécula solúvel em água. Um derivado comumente usado de biotina para experimentos de rotulagem superficial é o sulfo-NHS-SS-biotina, que consiste no grupo sulfo, o grupo de éster de succinimida N-hidroxy, a ligação dissulfeto e, claro, a biotina. Vamos simplificar essa enorme estrutura substituindo a biotina pela letra "B".
O grupo sulfo nesta estrutura dá uma forte carga que torna esta forma de membrana biotina impermeável. A rotulagem de proteínas da superfície celular é feita adicionando sulfo-NHS-SS-biotina às células mantidas a uma temperatura restritiva à endocitose. O grupo NHS reage com as aminas primárias em proteínas superficiais, formando ligações covalentes.
Em seguida, as células rotuladas são movidas para uma temperatura permissiva à endocitose, durante a qual algumas das proteínas rotuladas serão internalizadas. Finalmente, as células são movidas de volta à temperatura restritiva para parar a endocitose. A fim de quantificar especificamente proteínas internalizadas, um agente redutor hidrofílico, de membrana-impermeável — como L-glutathione — é adicionado. Isso reagirá com os laços de dissulfeto na biotina sulfo-NHS-SS não-estiúde. Neste ponto, as proteínas biotiniladas remanescentes são aquelas cujos rótulos estavam protegidos do agente redutor porque foram previamente internalizados.
As células são então dilatadas, e as proteínas biotiniladas endócitas são isoladas para serem quantificadas. O isolamento é geralmente realizado adicionando lises celulares a contas sintéticas revestidas com streptavidina. Uma vez que streptavidina tem uma afinidade extremamente alta para a biotina, as proteínas biotinylated se prendem às contas revestidas. Uma série de passos de lavagem para remover proteínas contaminantes, e por último um passo de eluição, é realizada para liberar proteínas ligadas. As proteínas-alvo podem então ser analisadas por técnicas como a mancha ocidental.
Como agora você conhece os conceitos por trás do ensaio de biotinilação, vamos olhar para um protocolo generalizado mostrando como realizar esse procedimento para medir a endocitose das proteínas superficiais.
Comece com células cultivadas resfriadas a 4°C. Coloque-os no gelo para manter a temperatura restritiva à endocitose. Em seguida, o reagente de sulfo-NHS-SS-SS-ss de membrana é adicionado, e as células são incubadas no escuro por aproximadamente 30 minutos. Isso permite tempo suficiente para que os rótulos de biotina se conectem covalentemente às proteínas superficiais. As células são então removidas do gelo e incubadas a 37°C por aproximadamente 30 minutos. A esta temperatura, proteínas superficiais biotiniladas são endocitas. Após a incubação, as células são resfriadas a 4°C, e um agente redutor hidrofílico como L-glutathione é adicionado. Isso reage com ligações de dissulfeto e libera os grupos de biotina de proteínas rotuladas e não endócias.
Em seguida, as células são diluidas pela centrifugação, quebrando assim as membranas celulares e expondo proteínas biotiniladas. Depois disso, os lises são adicionados a contas revestidas de streptavidin e proteínas biotiniladas são permitidas a se ligar. As contas são lavadas com soro fisiológico tamponado de fosfato frio e elucidadas com um tampão contendo detergentes e agentes redudores. Estes reagentes desnaturam proteínas fora das contas e permitem sua recuperação no elunato. As proteínas no eluato são separadas com base em sua massa molecular por eletroforese de gel. Por fim, a mancha ocidental e a sondagem da mancha com anticorpos específicos de proteínas permitem a visualização da proteína alvo. A proteína endocitoxada percentual pode ser quantificada a partir das densidades de banda resultantes.
Agora que você entende a metodologia da biotintilação celular, vamos ver como ela é usada em experimentos específicos.
A aplicação mais comum deste protocolo de biotinilação é medir a taxa endocítica de proteínas específicas da superfície celular. Aqui, os cientistas estavam interessados em avaliar a internalização do transportador de dopamina ou DAT. Seguindo o protocolo padrão, os cientistas foram capazes de medir a porcentagem de DATs endócitos. Trata-se de um imunoblot representativo que mostra a faixa T, correspondente à quantidade "total" de proteína antes da internalização, a faixa S é para amostras "despojadas" onde as células nunca foram autorizadas a proceder através da endocitose, mas tratadas com agente redutor, e a faixa I representa resultados de proteínas "internalizadas".
Além de apenas medir a endocitose das proteínas superficiais, os cientistas também examinam os efeitos das drogas nesse processo. Neste estudo, os pesquisadores avaliaram a densidade superficial dos DATs em resposta ao tratamento com um ativador de proteína quinase C (PKC), cuja ação foi sugerida para induzir a internalização do DAT. Os cientistas confirmaram isso adaptando o protocolo de biotintilação in vitro para uso em um ensaio ex vivo no tecido cerebral do camundongo. Os dados revelaram uma perda de aproximadamente 30% do DAT da membrana celular, em resposta à ativação do PKC.
Por fim, ao ajustar o ensaio de biotintilação, os cientistas também podem medir a reciclagem de proteínas de membrana. Aqui, os pesquisadores estavam investigando a proteína do canal de superfície, CFTR, responsável pela realização de íons de cloreto. Para avaliar a reciclagem, os pesquisadores realizaram um protocolo padrão de biotinilação em um grupo de células, e modificaram o protocolo para o segundo grupo de células adicionando passos após a retirada da biotina das proteínas superficiais não endócitas. Essas etapas adicionais incluíram elevar a temperatura de volta para 37°C para permitir a reciclagem de algumas das proteínas receptoras internalizadas e marcadas por biotina. Calculando a diferença entre as proteínas internalizadas antes e depois da reciclagem ocorrer, esses cientistas foram capazes de quantificar percentual de CFTR reciclado de volta à membrana.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE ao ensaio de biotintilação da superfície celular. O vídeo descreveu as etapas processuais deste ensaio, e explicou a reação ocorrendo a cada passo. Por fim, exploramos alguns exemplos de experimentos que demonstraram a aplicabilidade desse método. Como sempre, obrigado por assistir!
Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
