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소포 재활용의 FM 염색

Overview

FM 염료는 소포 재활용 공정을 연구하는 데 중요한 용도를 발견한 형광 분자의 클래스입니다. 화학 구조 덕분에, 이 분자는 인지질 이중층 막의 외부 전단지에 자신을 삽입할 수 있습니다. 멤브레인 삽입 후 내세포 소포를 통해 세포내재화되고 이러한 소포가 멤브레인으로 다시 재활용될 때 방출됩니다. 이러한 염료는 막 내의 소수성 환경에서 강하게 형광을 강하게 하고 세포외 구획에서 약하게, FM 형광 수준을 사용하여 재활용 공정 전반에 걸쳐 소포 활성을 추적할 수 있다.

이 비디오는 소포 재활용을 검사하기 위한 실험에서 FM 염료를 사용하는 방법을 소개합니다. 우리는 먼저 FM 염료의 생화학과 그들의 속성이 실험에서 그들의 사용을 허용하는 방법을 검토합니다. 그런 다음 이러한 연구에서 FM 염료를 사용하기위한 일반적인 프로토콜을 살펴보고 마지막으로 이러한 독특한 분자를 사용하는 몇 가지 최근 연구에 대해 논의합니다.

Procedure

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FM 염료는 소포 재활용을 이미지화하는 데 널리 사용되는 멤브레인 염료입니다. 이것은 세포가 세포 크기를 보존하고, 비싼 단백질을 재사용하고, 세포 외 공간으로 분자를 연속적으로 수송하기 위하여 그것의 자신의 막에서 소포를 형성하는 프로세스입니다. 이 과정은 신경 시 냅 스에서 가장 일반적으로 공부, 어디 그것은 신경 전달 물질의 릴리스에 관여. 소포 재활용을 검사하는 것 외에도, FM 염료는 크로마핀 세포의 분비 및 부상 후 세포막 수리와 같은 여러 가지 다른 현상을 연구하는 데 사용됩니다.

이 비디오는 소포 재활용을 연구하는 실험에서 FM 염료를 사용하는 데 중점을 둡니다. 우리는 자극 된 뉴런에서 재활용 프로세스를 정량화하기 위해 FM 염료를 사용하는 단계별 프로토콜을 통해 갈 것입니다. 마지막으로, 우리는 다른 방법으로이 독특한 분자를 활용 하는 몇 가지 예제 실험을 검토 합니다.

절차에 뛰어들기 전에 먼저 FM 염료의 생화학적 특성을 검토하여 소포 재활용 실험에서 자신의 기능을 이해하는 데 도움이 됩니다.

구조적으로, FM 염료는 그들을 합성 과학자에서 자신의 이름을 파생 하는 스타일 분자-페이 마오. 이 염료에는 머리, 꼬리 및 다리의 세 가지 주요 구조적 특징이 있습니다. 다리는 두 개의 방향족 고리로 구성되어 있으며, 그 사이에 는 가변 이중 결합 영역이 있습니다. 이 전체 섹션은 불소항을 만듭니다.

특정 흥분 파장에서 들어오는 빛에 의해 강타 될 때, 그 원자는 그 에너지를 흡수하고 흥분 상태로 전자를 제기 하는 어떤 불소 의 본질이다. 이 전자는 진동으로 에너지를 방출하여 지상 상태로 돌아, 마지막으로 방출 파장의 빛으로. 소수성 꼬리는 FM 분자가 세포막의 지질 이중 층으로 분할 할 수 있게하고, 그 친성 모성 헤드는 외부 막 전단지에 그것의 국소화를 제한하는 전하를 가지고 있습니다.

따라서 세포로 들어갈 수있는 유일한 방법은 내분비증을 통해서입니다. FM 염료는 급성 환경에 민감하며 극성 용매의 약한 형광을 나타내지만 멤브레인과 같은 소수성 환경에서 강한 형광을 보여줍니다. 이것은 형광 현미경을 사용하여 시각화하고 정량화될 수 있는 높은 대비 막 라벨을 만듭니다.

이러한 특성으로 인해 FM 염료는 시냅스에서 소포 재활용을 평가하는 데 특별히 적합합니다. 간단히 말해서, 이 과정은 FM 염료로 배양하는 것을 포함합니다. FM 분자중 일부는 현저히 그들의 형광 강도를 증가 하는 막에 연결 얻을. 다음으로, 자극은 막 내재화 과정을 개시합니다. 따라서 일부 FM 분자는 소포 막에 갇혀 있으며 나머지 외부 국소화 염료 분자는 씻어 낸다.

두 번째 자극에서, 내부 화된 스테인드 소포는 세포막과 융합하여 내용물들을 방출하고, 염료는 빠르게 분해되어 형광 강도가 급격히 감소합니다. 이 태상은 형광 현미경의 도움으로 정량화 될 수있다.

이제 FM 염료의 생화학 적 원리에 익숙해졌으니, 이러한 염료를 사용하여 시냅스 소포 재활용을 검사하는 실험을 수행하는 방법에 대한 절차를 검토해 보겠습니다.

커버립에 신경 배양의 깨끗하고 건강한 샘플은 사전에 준비됩니다. 이 세포는 FM 염료 용액으로 이동하여 멤브레인에 라벨이 부착됩니다. 시료 커버슬립은 현미경의 이미징 챔버에 장착됩니다.

세차와 같은 유체 조작을 허용하기 위해 유체 입력 및 출력 라인이 부착되어 밀봉 된 관류 챔버를 형성합니다. 형광 현미경의 단계에 챔버를 마운트. 챔버에 와이어를 부착하고 전기 자극기에 연결합니다. 일단 연결되면, 여기 및 방출 필터는 사용되는 FM 염료에 따라 설정됩니다.

내분비증을 통해 소포에 적재하는 것은 전기 자극을 사용하여 유도된다. 자극 후 신경 단자는 회복할 수 있습니다. 그런 다음 세포 외 염료가 버퍼로 세척됩니다. 이것은 또한 배경 형광을 최소화합니다. FM 염료가 장시간 흥분으로 인해 형광 강도가 약화되는 광표백에 걸리기 쉽기 때문에 흥분 강도를 최소화하는 것이 중요합니다. 짧은 잠복에 따라 초기 이미지가 얻어진다. 다음으로, 외세포증은 제2 전기 신호로 유도된다.

자극 다음 의 다른 시점에서 형광을 측정 한 후, 끝에, 신경 단자는 철저하게 모든 재발 가능한 염료를 언로드하도록 자극 될 수있다. 그 후에 남아 있는 형광은 배경 형광 강도로 간주됩니다. 이어서, 각 이미지의 본질적인 형광은 이미지의 비시냅스 영역에서 "관심 영역" 도구를 사용하여 측정된다. 배경 형광 및 본질형 형광은 각 시간 지점의 형광 강도에서 빼어 정상화된 형광 강도를 얻을 수 있으며, 이는 시간 대 플롯됩니다. 시간이 지남에 따라 강도의 감소는 비하를 나타내며, 이는 소포 재활용의 간접적인 척도입니다.

이제 방법론을 검토한 후 특정 실험에서 FM 염료가 어떻게 사용되는지 살펴보겠습니다.

우리는 자극 된 뉴런에서 FM 염료를 사용하여 프로토콜에 대해 논의했습니다. 여기서 과학자들은 자발적인 소포 재활용을 연구하는 데 관심이 있었습니다. 그(것)들은 형광 강렬에 있는 작은 변경을 검출하기 위하여 충분히 민감한 화상 진찰 시스템과 조합하여 확립된 프로토콜을 사용하여 이것을 했습니다. 결과는 자발적인 시냅스 방출로 직접 인한 형광 강도의 감소를 나타낸다.

사전 시냅스 뉴런 내에서 소포는 예비 풀 또는 RP, 그리고 쉽게 재조정 가능한 풀 또는 RRP의 두 개의 풀로 나뉩니다. 여기서 과학자들은 FM 염료를 사용하여 소포 개체 집단의 각 유형의 분수를 분석했습니다. 증가 강도의 전기 자극의 순차적 적용에 의해, 이러한 과학자들은 소포 풀의 각 유형의 상대적 비율을 정량화 할 수 있었다.

마지막으로, 세포 생물학자는 또한 부상당한 혈장 막의 외세포 수리에 관련되었던 요인을 해부하기 위하여 FM 염료를 이용합니다. 이 실험에서, 연구원은 특히 막 재밀봉 과정에서 지질 변형 효소인 스핑고미엘라제의 역할에 초점을 맞추게 되었습니다. 첫째, 그들은 RNA 처리를 침묵의 도움으로 효소 sphingomyelinase에 있는 결핍세포를 생성했습니다. 다음으로, 그(것)들은 이 세포 및 외인성 FM 염료및 혈장 막 병변을 만드는 독소로 대조군을 취급했습니다. 마지막으로, 그들은 공초점 현미경을 사용하여 모든 샘플을 보았습니다. 결과는 sphingomyelinase 결핍 세포가 세포내 FM 분자의 견고한 축적을 보여주었다는 것을 보여주었습니다. 한편, 대조구는 최소한의 FM 유입을 보였으며, 플라즈마 멤브레인 수리에서 스핑크고미엘리나제의 역할을 제안하였다.

당신은 소포 재활용에서 FM 염료에 JoVE의 비디오를 보았다. 이 비디오는 FM 염료의 생화학을 설명하고 시냅스 소포 재활용을 염색하고 정량화하는 프로토콜을 자세히 설명했으며, 마침내 이러한 염료를 다른 방식으로 활용한 현재 실험을 설명했습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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