Overview
אחד מסימני ההיכר של אפופטוזיס הוא פיצול הדנ"א הגרעיני על ידי גרעינים. אנזימים אלה מופעלים על ידי כספיות, משפחת החלבונים המבצעים את תוכנית המוות של התא. TUNEL assay היא שיטה המנצלת תכונה זו כדי לזהות תאים אפופוטוטיים. בבחינה זו, אנזים הנקרא מסוף deoxynucleotidyl transferase מזרז את התוספת של נוקלאוטידים dUTP לקצוות חינם 3 'של DNA מקוטע. באמצעות dUTPs המסומנים בתגים כימיים שיכולים לייצר פלואורסצנטיות או צבע, ניתן לזהות תאים אפופטוטיים באופן ספציפי.
הסרטון של JoVE על מבזק TUNEL מתחיל בדיון כיצד ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לזהות תאים אפופטוטיים. לאחר מכן אנו עוברים פרוטוקול כללי לביצוע בדיקות TUNEL על מקטעי רקמות והדמיה של התוצאות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לבסוף, מספר יישומים של ההסתה למחקר הנוכחי יכוסו.
Procedure
בדיקת TUNEL משמשת בדרך כלל כדי לזהות תאים העוברים אפופטוזיס, שהוא סוג של מוות תאים מתוכנת. אפופטוזיס הוא תהליך ביולוגי חשוב במהלך הפיתוח, ולשמירה על הומאוסטזיס של רקמות. כתמי TUNEL מאפשרים הדמיה וכימות של תאים אפופוטוטיים. זה עוזר למדענים לבדוק את היעילות של טיפולים חדשים להפרעות שבהן אפופטוזיס מעוכב, כמו בסרטן, או משופר, כמו ניוון עצבי.
וידאו זה יסביר כיצד ניתן להשתמש בבדיקת TUNEL כדי לתייג תאים העוברים אפופטוזיס, פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע שיטה זו במקטעי רקמות, וכיצד חוקרים מיישמים טכניקה זו כדי להבין מנגנוני מוות של תאים.
לפני להתעמק בפרוטוקול של מנסרה TUNEL, בואו לדון בעקרונות מאחורי טכניקה זו.
אחד המאפיינים הרבים של אפופטוזיס הוא פיצול DNA. כיצד מתרחש פיצול דנ"א? אפופטוזיס מתבצע על ידי אנזימים הנקראים קפסות הנמצאים בציטוסול. תפקידם העיקרי הוא לבקע חלבונים כדי לפרק את התא. בנוסף, קפסות מפעילות אנזים הנקרא DNase המופעל באמצעות קספאז, או CAD, על-ידי ניתוקו מהמעכב שלו – ICAD. CAD פעיל הוא אנדונוקלאז שנוסע לגרעין ומבקע דנ"א כרומוזומלי.
מחשוף הדנ"א גורם בסופו של דבר להצטברות של שברי דנ"א עם קצוות קרועים, והבוחן של TUNEL מתייג באופן פלואורסצנטי את הקצוות החתכים האלה של דנ"א מקוטע, ומאפשר למדענים לזהות אפופטוזיס. אבל איך זה קורה? בשביל זה אתה צריך להבין את התגובה TUNEL. TUNEL מייצג את תיוג סוף deoxynucleotidyl transferase בתיווך dUTP ניק-אנד. שני ריאגנטים TUNEL העיקריים הם מסוף deoxynucleotidyl transferase, או TdT, ו deoxyuridine triphosphate, או dUTP, אשר עשוי להיות מתויג פלואורסצנטית להקלה על זיהוי.
כדי להבין את תגובת TUNEL, בואו נחזור לתאים אפופטוטיים עם שברי DNA. שברים אלה חתוך יש 3′ קבוצות הידרוקסיל חינם. לאחר הוספת ריאגנטים TUNEL לדגימה המכילה תאים אפופוטוטיים, dUTPs שכותרתו פלואורסצנטית לצרף אלה 3′ קבוצות הידרוקסיל בעזרת אנזים זרז TdT. התאים המוכתמים באמצעות הליך זה נקראים תאים חיוביים TUNEL, אשר לאחר מכן ניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
עכשיו שאתם מבינים את העקרונות והמושגים הבסיסיים מאחורי בדיקת TUNEL, בואו נתווה פרוטוקול כללי לביצוע טכניקה זו בקטעי רקמות. השלבים העיקריים של בדיקת TUNEL כוללים תיקון רקמת העניין, חרוז של הרקמה, הוספת ריאגנטים TUNEL, עצירת התגובה TUNEL, ולבסוף את הניתוח.
ראשית, יש לתקן את רקמת העניין על מנת לשמר מבנים ביולוגיים. קיבעון פועל על ידי קישור חלבונים בתוך תאים. עבור בדיקת TUNEL, ניתן לתקן רקמות על ידי הוספתם לתמיסה המכילה 4% paraformaldehyde במשך 4-24 שעות ב 4°C. לאחר קיבעון, cryosection הרקמה לפרוסות דקות של 10 מיקרומטר או פחות.
השלב הבא הוא פרמבביליזציה, המאפשר ריאגנטים כגון האנזים TdT לחדור את גרעין התא. פרמזביליזציה של מקטעי רקמות יכולה להתבצע על ידי הוספת הרקמה לתמיסת חלבון K במשך 5-15 דקות ב 37°C. יש לשטוף מקטעי רקמות עם תמיסת מלח חוצץ פוספט על שייקר מסלולי במשך 15-30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר פרמזביליזציה, האנזים TdT ו dUTPs שכותרתו פלואורסצנטית מתווספים למקטעי הרקמה, יחד עם מאגר תיוג המכיל קובלט המשמש כקופרט לתגובת TUNEL. יחד, תערובת התגובה TUNEL ואת קטע הרקמה הם דגירה במשך 1-3 שעות ב 37°C, מוגן מפני אור כדי למנוע את הפלואורסצנטיות מפני דהייה.
לאחר הדגירה, חוצץ עצור מתווסף לקטע הרקמה כדי להפסיק את תגובת TUNEL, ולאחר דגירה קצרה הסעיפים נשטפים עם תמיסת מלח חוצצת פוספט. לבסוף, מקטעי רקמות מוכתמים באמצעות dUTP מתויג פלואורסצנטית הם דמיינו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ומוערך עבור לוקליזציה של תאים חיוביים TUNEL בתוך רקמה נתונה. אפשר לכמת מוות של תאים פשוט על ידי ספירת אחוז התאים החיוביים של TUNEL במקטע רקמות נתון.
כעת, לאחר שראיתם כיצד לבצע את מבעודת TUNEL כדי לזהות תאים אפופטוטיים, בואו נדון כיצד ניתן להשתמש בבחינת זו כדי לענות על שאלות שנשאלו על ידי ביולוגים של תאים.
מוות תאי מתרחש כחלק נורמלי של התפתחות לפיסול של רקמות ומבנים, ועל חיסול תאים מיותרים. לכן, מדענים המעוניינים בתופעה זו חוקרים את ההשפעה של חשיפה טרום הילודים לחומרים שונים על אפופטוזיס במהלך הפיתוח. כאן, מדענים התעניינו בבחינת ההשפעה של חשיפה לאלכוהול טרום הילודים על התפתחות המוח. התוצאות של כתמי TUNEL שבוצעו על מוחות עובריים חשפו אפופטוזיס מוגבר ברקמות שנחשפו מראש לאלכוהול, בהשוואה לבעלי חיים שליטה.
מדענים גם משתמשים בבדיקת TUNEL כדי לחקור אפופטוזיס בתגובה לזיהום חיידקי. בניסוי זה, מדענים פיתחו מודל של דלקת ריאות על ידי הזרקת עכברים עם פסאודומונס aeruginosa, אשר גורמת לדלקת ריאות. לאחר מכן, רקמת הריאה הוסרה והכתמת TUNEL בוצעה כדי לבחון אפופטוזיס בתגובה לזיהום החיידקי. התוצאות מראות כי מוות תאי אפופטוטי גדל בעכברים שנחשפו לחיידקים, בהשוואה לבעלי חיים שליטה.
לבסוף, כתמי TUNEL ניתן להשתמש על דגימות גידול אנושי, על מנת לקבוע את תגובת הגידול לתרופות. בדוגמה זו, דגימות גידול נקצרו מחולים אנושיים ואקס ויוו תרבותית. לאחר מכן, הם טופלו בתרופות פרה-קליניות והוערכה לתגובה באמצעות מבעודת TUNEL. נתונים שהתקבלו מראים כי טיפול בתרופה המעכבת חלבון הלם חום 90 מגדיל באופן משמעותי אפופטוזיס ברקמת הגידול.
הרגע צפית בסרטון של JoVE על השימוש בבדיקת TUNEL כדי לזהות תאים שעוברים אפופטוזיס. וידאו זה סקר את העקרונות מאחורי מכתים TUNEL, ופרוטוקול צעד אחר צעד כדי לבצע את הבדיקה TUNEL על קטעי רקמות. בדקנו גם כיצד ניתן ליישם שיטה זו כדי להבין מוות תאי מתוכנת במהלך התפתחות ומחלות. כמו תמיד, תודה שצפית!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
