Overview
Una de las características de la apoptosis es la fragmentación del ADN nuclear por nucleasas. Estas enzimas son activadas por caspasas, la familia de proteínas que ejecutan el programa de muerte celular. Ensayo de túnel es un método que aprovecha esta característica para detectar células apoptóticas. En este ensayo, una enzima llamada terminal deoxynucleotidyl transferasa cataliza la adición de dUTP nucleótidos a los extremos 3' libre de ADN fragmentado. Mediante el uso de dUTPs que están etiquetados con las etiquetas químicas que pueden producir color o fluorescencia, pueden identificarse específicamente células apoptóticas.
Video de Zeus en el ensayo TUNEL comienza discutiendo cómo puede utilizarse esta técnica para detectar células apoptóticas. Luego pasamos por un protocolo general para realizar ensayos TUNEL en secciones de tejidos y visualizar los resultados utilizando microscopía de fluorescencia. Por último, se tratarán varias aplicaciones del análisis a la investigación actual.
Procedure
El ensayo TUNEL se utiliza comúnmente para detectar las células que experimentan apoptosis, que es una forma de muerte celular programada. La apoptosis es un proceso biológico importante durante el desarrollo y para mantener la homeostasis del tejido. Tinción TUNEL permite visualización y cuantificación de células apoptóticas. Esto ayuda a los científicos probar la eficacia de nuevos tratamientos para trastornos en que apoptosis inhibida, como en el cáncer, o mejorado, como en la neurodegeneración.
Este video explica cómo el ensayo TUNEL se puede utilizar para identificar las células que experimentan apoptosis, un protocolo paso a paso para realizar este método en secciones del tejido, y cómo los investigadores están aplicando esta técnica para entender los mecanismos de muerte celular.
Antes de profundizar en el protocolo del ensayo TUNEL, vamos a discutir los principios detrás de esta técnica.
Una de las muchas características de la característica distintiva de la apoptosis es la fragmentación del ADN. ¿Cómo se produce la fragmentación del ADN? Apoptosis se lleva a cabo por enzimas llamadas caspasas presentes en el citosol. Su función principal es hienden las proteínas con el fin de desmantelar la célula. Además, caspasas activan una enzima llamada ADNasa activada por caspasa, o CAD, desprendiendo de su inhibidor, ICAD. Activado de la CAD es una endonucleasa que viaja al núcleo y separa el ADN cromosómico.
Clivaje de ADN en última instancia causa acumulación de fragmentos de ADN con extremos melladas, el ensayo TUNEL fluorescente etiquetas y estas Mellado extremos de ADN fragmentado, permitiendo a los científicos a detectar apoptosis. Pero ¿cómo sucede esto? Para eso tienes que entender la reacción de TUNEL. TUNEL es terminal deoxynucleotidyl transferasa-mediated dUTP nick-end etiquetado. Los dos reactivos TUNEL principal son transferasa terminal del deoxynucleotidyl, o TdT y desoxiuridina trifosfato o dUTP, que puede ser etiquetado fluorescente para facilitar su detección.
Para entender la reacción de TUNEL, volvamos a las células apoptóticas con fragmentos de ADN. Mellado fragmentos tienen grupos de hidroxilo 3 ' libre. Una vez agregar los reactivos TUNEL a una muestra que contenga células apoptóticas, las fluorescencia de etiquetado dUTPs colocar a estos grupos de hidroxilo 3 ' con la ayuda de la enzima catalizador TdT. Las células teñidas mediante este procedimiento se llaman las células positivas TUNEL, que luego pueden ser visualizadas mediante microscopía de fluorescencia.
Ahora que usted comprende los principios básicos y conceptos detrás del ensayo TUNEL, vamos a esbozar un protocolo general para la realización de esta técnica en las secciones de tejido. Los pasos principales del ensayo TUNEL incluyen fijación del tejido de interés, permeabilización del tejido, adición de reactivos TUNEL, parando la reacción del TUNEL y finalmente el análisis.
En primer lugar, el tejido de interés debe ser fijado con el fin de preservar las estructuras biológicas. Fijación trabaja por reticulación de proteínas dentro de células. Para el ensayo TUNEL, los tejidos se pueden fijar mediante la adición a una solución conteniendo paraformaldehído al 4% de 4 a 24 horas a 4° C. Después de la fijación, criosección el tejido en rodajas de 10 μm o menos.
El siguiente paso es la permeabilización, que permite para reactivos, tales como la enzima TdT para penetrar el núcleo celular. Permeabilización de las secciones de tejido se puede realizar añadiendo el tejido a la solución de proteinasa K durante 5-15 minutos a 37° C. Enjuague las secciones de tejido con tampón fosfato salino en un agitador orbital durante 15 – 30 minutos a temperatura ambiente.
Tras la permeabilización, la enzima TdT y fluorescencia etiquetada dUTPs se agregan a las secciones de tejido, junto con un tampón etiquetado que contiene cobalto que actúa como cofactor de la reacción de TUNEL. Juntos, la mezcla de reacción de TUNEL y la sección del tejido se incuban durante 1 – 3 horas a 37° C y protegidos de la luz para evitar la fluorescencia del descoloramiento.
Tras la incubación, tope se agrega a la sección del tejido a la reacción de TUNEL, y después de una corta incubación las secciones se lavaron con tampón fosfato Salinas. Finalmente, las secciones de tejido teñidas usando fluorescencia etiquetada dUTP se visualizan utilizando microscopía de fluorescencia y evaluado para la localización de las células positivas TUNEL dentro de un determinado tejido. Uno puede cuantificar muerte celular simplemente por contar el porcentaje de células positivas TUNEL en una sección de tejido dado.
Ahora que has visto cómo realizar el ensayo TUNEL para detectar las células apoptotic, vamos a discutir cómo se puede utilizar este ensayo abordar preguntas por biólogos de la célula.
Muerte celular se produce como una parte normal del desarrollo de la escultura de los tejidos y estructuras y la eliminación de células innecesarias. Por lo tanto, los científicos interesan en el estudio de este fenómeno el efecto de la exposición prenatal a sustancias diferentes en apoptosis durante el desarrollo. Aquí, los científicos estaban interesados en examinar el efecto de la exposición prenatal del alcohol sobre el desarrollo del cerebro. Los resultados de la tinción TUNEL realizan en cerebros fetales revelaron mayor apoptosis en los tejidos que fueron expuestos prenatalmente al alcohol, en comparación con los animales de control.
Los científicos también utilizan el ensayo TUNEL para investigar apoptosis en respuesta a una infección bacteriana. En este experimento, los científicos desarrollaron un modelo de neumonía inyectando ratones con Pseudomonas aeruginosa, que induce la inflamación del pulmón. Entonces, tejido pulmonar fue quitado y tinción TUNEL fue realizada para examinar la apoptosis en respuesta a la infección bacteriana. Los resultados muestran que la muerte celular apoptótica aumentó en ratones expuestos a las bacterias, en comparación con los animales de control.
Por último, tinción TUNEL puede utilizarse en muestras de tumores humanos, con el fin de determinar la capacidad de respuesta del tumor a las drogas. En este ejemplo, las muestras del tumor fueron extraídas de pacientes humanos y cultivadas ex vivo. A continuación, fueron tratados con los medicamentos y evaluar una respuesta usando el ensayo TUNEL. Datos obtenidos muestran que el tratamiento con un fármaco que inhibe la proteína de choque térmico 90 significativamente aumenta apoptosis en tejido tumoral.
Sólo has visto video de Zeus para detectar células que experimentan apoptosis, usando el ensayo TUNEL. Este vídeo repasa los principios detrás de tinción TUNEL y un protocolo paso a paso para realizar el ensayo TUNEL en secciones de tejidos. También repasamos cómo este método puede aplicarse para entender la muerte celular programada durante el desarrollo y la enfermedad. ¡Como siempre, gracias por ver!
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