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Cell Biology

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Overview

세포멸의 특징 중 하나는 핵에 의한 핵 DNA 단편화이다. 이 효소는 세포 죽음 프로그램을 실행하는 단백질의 가족인 caspases에 의해 활성화됩니다. TUNEL 분석법은 이 기능을 활용하여 세포 세포를 검출하는 방법입니다. 이 분석에서, 말기 탈옥핵통측이라고 불리는 효소는 단편화된 DNA의 자유 3'끝에 dUTP 뉴클레오티드의 첨가를 촉매한다. 형광 또는 색상을 생성할 수 있는 화학 태그로 표지된 dUTP를 사용하여, 세포 세포는 구체적으로 규명될 수 있다.

TUNEL 분석법에 대한 JoVE의 비디오는 이 기술을 사용하여 세포 세포를 감지하는 방법을 논의함으로써 시작됩니다. 그런 다음 조직 섹션에 TUNEL 분석 법을 수행하고 형광 현미경 검사를 사용하여 결과를 시각화하기위한 일반적인 프로토콜을 거치습니다. 마지막으로, 현재 연구에 대한 분석의 여러 응용 프로그램이 적용됩니다.

Procedure

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TUNEL 분석은 가장 일반적으로 프로그램 된 세포 죽음의 한 형태인 세포 세포 사멸을 겪고있는 세포를 검출하는 데 사용됩니다. Apoptosis는 개발 하는 동안 중요 한 생물학적 과정, 그리고 조직 항상성을 유지 하기 위한. TUNEL 염색을 통해 세포 세포의 시각화 및 정량화를 가능하게 합니다. 이것은 과학자가 세포사멸이 암에서 같이, 또는 향상되는 무질서를 위한 새로운 처리의 효험을 시험하는 것을 돕습니다, 신경 변성에서와 같이.

이 비디오는 TUNEL 분석이 세포 사멸을 겪고 있는 세포, 조직 섹션에서이 방법을 수행하기위한 단계별 프로토콜, 그리고 연구원이 세포 사멸의 메커니즘을 이해하기 위해이 기술을 적용하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.

TUNEL 분석기의 프로토콜을 자세히 탐구하기 전에 이 기술의 원리에 대해 설명해 보겠습니다.

석 멸 착증의 많은 특징 특성 중 하나는 DNA 단편화. DNA 단편화는 어떻게 발생합니까? 세포멸은 사이토솔에 존재하는 카스파스에게 불린 효소에 의해 수행됩니다. 그들의 주요 역할은 세포를 해체하기 위하여 단백질을 cleave하는 것입니다. 또한, caspases는 카스파스 활성화 DNase, 또는 CAD에게 불린 효소를 그것의 억제제-ICAD에서 분리해서 활성화합니다. 활성화된 CAD는 핵으로 이동하고 염색체 DNA를 갈라놓는 엔도노클레스입니다.

DNA의 분열은 궁극적으로 별명 끝으로 DNA 파편의 축적을 일으키는 원인이 되고, TUNEL 분석은 단편화된 DNA의 이 닉한 끝을 형광으로 표시하여 과학자가 자멸을 검출할 수 있게 합니다. 그러나 어떻게 이런 일이 일어날까요? 이를 위해 TUNEL 반응을 이해해야 합니다. TUNEL은 말단 탈옥뉴클레오디딜 트랜스포니어-매개 dUTP 닉 엔드 라벨링을 의미합니다. 2개의 주요 TUNEL 시약은 말단 탈옥뉴클레오디딜 트랜스포메이징, 또는 TdT, 및 deoxyuridine 삼위산염, 또는 dUTP이며, 이는 검출의 용이성을 위해 형광으로 표시될 수 있다.

TUNEL 반응을 이해하기 위해 DNA 단편을 가진 세포로 돌아가봅시다. 이 별명 조각은 무료 3′ 하이드록실 그룹이 있습니다. 당신은 세포 세포세포를 포함하는 샘플에 TUNEL 시약을 추가하면, 형광 표지 dUTP는 촉매 효소 TdT의 도움으로 이 3′ 하이드록실 단에 연결합니다. 이 절차를 사용하여 염색된 세포는 TUNEL 양성 세포에게 불리고, 이는 형광 현미경 검사를 사용하여 시각화될 수 있습니다.

이제 TUNEL 분석의 기본 원칙과 개념을 이해하게 되었으므로 조직 섹션에서이 기술을 수행하기위한 일반적인 프로토콜을 설명해 보겠습니다. TUNEL 분석법의 주요 단계는 관심의 조직을 고정 포함, 조직의 투과화, TUNEL 시약을 추가, TUNEL 반응을 중지, 마지막으로 분석.

첫째, 생물학적 구조를 보존하기 위해서는 관심 있는 조직을 고정해야 한다. 고정은 세포 내의 단백질을 교차연결하여 작동합니다. TUNEL 분석의 경우 4°C에서 4~24시간 동안 파라포름알데히드를 4~24시간 동안 포함하는 용액에 조직을 추가하여 조직을 수정할 수 있습니다. 고정 후, 극저온은 조직을 10 μm 이하의 얇은 조각으로 분해합니다.

다음 단계는 TdT 효소와 같은 시약을 세포 핵에 침투할 수 있는 투과성입니다. 조직 섹션의 투과화는 37°C에서 5-15분 동안 단백질라제 K 용액에 조직을 추가하여 수행할 수 있다. 실온에서 15-30 분 동안 궤도 셰이커에 인산염 완충 식염수를 가진 조직 섹션을 헹구세요.

투과화에 이어, TdT 효소와 형광으로 표지된 dUTP가 조직 섹션에 추가되고, TUNEL 반응의 보조인 역할을 하는 코발트를 함유하는 라벨링 버퍼가 추가된다. 함께, TUNEL 반응 혼합물및 조직 단면도는 37°C에서 1-3시간 동안 배양되고, 형광이 퇴색하는 것을 방지하기 위하여 빛으로부터 보호됩니다.

인큐베이션에 이어, 스톱 버퍼는 TUNEL 반응을 중단하기 위해 조직 섹션에 첨가되고, 짧은 인큐베이션 후 단면도는 인산염 완충식식염으로 세척된다. 마지막으로, 형광 태그dUTP를 사용하여 염색된 조직 섹션은 형광 현미경 검사를 사용하여 시각화되고 주어진 조직 내에서 TUNEL 양성 세포의 국소화를 위해 평가됩니다. 하나는 주어진 조직 섹션에서 TUNEL 양성 세포의 비율을 계산하여 단순히 세포 죽음을 정량화 할 수 있습니다.

이제 세포 세포를 검출하기 위해 TUNEL 분석법을 수행하는 방법을 보았으니, 세포 생물학자들이 묻는 질문을 해결하기 위해 이 분석법을 어떻게 사용할 수 있는지 살펴보겠습니다.

세포 사멸은 조직과 구조물의 조각, 불필요한 세포의 제거를 위한 발달의 일반적인 부분으로 생깁니다. 따라서 이 현상에 관심이 있는 과학자들은 발달 중에 세포사멸에 대한 다른 물질에 대한 산전 노출의 효과를 연구합니다. 여기에서, 과학자는 두뇌 발달에 산전 알콜 노출의 효력을 검토에 관심이 있었습니다. 태아 두뇌에 수행 된 TUNEL 염색의 결과 밝혀 알코올에 전산적으로 노출 된 조직에 증가 apoptosis, 제어 동물에 비해.

과학자는 또한 세균성 감염에 응하여 자멸을 조사하기 위하여 TUNEL 분석기를 이용합니다. 이 실험에서 과학자들은 폐 염증을 유발하는 슈도모나스 아에루기노사로마우스를 주입하여 폐렴 모델을 개발했습니다. 이어서, 폐조직을 제거하고 TUNEL 염색을 수행하여 세균감염에 대응하여 석멸을 검사했다. 결과는 대조동물에 비해 박테리아에 노출된 마우스에서 세포 사멸이 증가했다는 것을 보여줍니다.

마지막으로, TUNEL 염색은 약물에 대한 종양 반응성을 결정하기 위해 인간 종양 샘플에 사용될 수 있다. 이 예에서, 종양 샘플은 인간 환자로부터 수확되고 배양된 ex vivo. 다음으로, 그들은 전임상 약물로 치료되었고 TUNEL 분석서를 사용하여 반응을 평가했습니다. 얻은 데이터는 열 충격 단백질을 억제하는 약물(90)을 가진 치료가 종양 조직에서 세포사락을 크게 증가시킨다는 것을 보여준다.

당신은 방금 자멸을 겪고 세포를 감지하기 위해 TUNEL 분석기를 사용하여 JoVE의 비디오를 시청했습니다. 이 비디오는 TUNEL 염색뒤에 원리를 검토하고, 조직 단면도에 TUNEL 분석기를 능력을 발휘하기 위하여 단계별 프로토콜을 검토했습니다. 우리는 또한 이 방법이 발달과 질병 도중 프로그램된 세포 죽음을 이해하기 위하여 적용될 수 있는 방법을 검토했습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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