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Cell Biology

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Overview

Uma das marcas da apoptose é a fragmentação do DNA nuclear por núcleos. Essas enzimas são ativadas por caspases, a família de proteínas que executam o programa de morte celular. O ensaio TUNEL é um método que aproveita esse recurso para detectar células apoptóticas. Neste ensaio, uma enzima chamada terminal deoxynucleotidyl transferase catalisa a adição de nucleotídeos dUTP às extremidades livres de DNA fragmentado. Usando dUTPs que são rotulados com etiquetas químicas que podem produzir fluorescência ou cor, as células apoptóticas podem ser identificadas especificamente.

O vídeo de JoVE sobre o ensaio TUNEL começa discutindo como essa técnica pode ser usada para detectar células apoptóticas. Em seguida, passamos por um protocolo geral para a realização de ensaios TUNEL em seções de tecido e visualização dos resultados usando microscopia de fluorescência. Finalmente, várias aplicações do ensaio à pesquisa atual serão abordadas.

Procedure

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O ensaio tunel é mais comumente usado para detectar células submetidas à apoptose, que é uma forma de morte celular programada. A apoptose é um importante processo biológico durante o desenvolvimento, e para a manutenção da homeostase tecidual. A coloração tunel permite a visualização e quantificação das células apoptóticas. Isso ajuda os cientistas a testar a eficácia de novos tratamentos para distúrbios nos quais a apoptose é inibida, como no câncer, ou melhorada, como na neurodegeneração.

Este vídeo explicará como o ensaio tunel pode ser usado para rotular células submetidas à apoptose, um protocolo passo-a-passo para a realização deste método em seções de tecido, e como os pesquisadores estão aplicando essa técnica para entender mecanismos de morte celular.

Antes de mergulhar no protocolo do ensaio TUNEL, vamos discutir os princípios por trás dessa técnica.

Uma das muitas características marcantes da apoptose é a fragmentação do DNA. Como ocorre a fragmentação do DNA? A apoptose é realizada por enzimas chamadas caspases presentes no citosol. Seu papel principal é cortar proteínas para desmontar a célula. Além disso, as caspases ativam uma enzima chamada DNase ativada por caspase, ou CAD, desprendendo-a de seu inibidor — ICAD. CAD ativado é uma endonuclease que viaja para o núcleo e corta DNA cromossômico.

O decote do DNA acaba por causar acúmulo de fragmentos de DNA com pontas cortadas, e o ensaio tunel rotula fluorescentemente essas extremidades cortadas de DNA fragmentado, permitindo que os cientistas detectem apoptose. Mas como isso acontece? Para isso você tem que entender a reação tunel. TUNEL significa terminal deoxynucleotidyl transferase-mediado dUTP rotulagem nick-end mediada. Os dois reagentes tunel principais são transferase deoxynucleotidyl terminal, ou TdT, e triphosfato desoxyuridina, ou dUTP, que pode ser rotulado fluorescentemente para facilitar a detecção.

Para entender a reação tunel, vamos voltar para as células apoptóticas com fragmentos de DNA. Estes fragmentos cortados têm grupos de hidroxíl de 3′ livres. Uma vez que você adicione os reagentes TUNEL a uma amostra contendo células apoptóticas, os dUTPs rotulados fluorescentemente se anexam a esses grupos de hidroxílico de 3′ com a ajuda da enzima catalisador TdT. As células manchadas usando este procedimento são chamadas células positivas TUNEL, que podem então ser visualizadas usando microscopia de fluorescência.

Agora que você entende os princípios e conceitos básicos por trás do ensaio TUNEL, vamos delinear um protocolo geral para a realização desta técnica em seções de tecido. Os principais passos do ensaio TUNEL incluem fixação do tecido de interesse, permeabilização do tecido, adição de reagentes TUNEL, interrupção da reação TUNEL e, finalmente, a análise.

Primeiro, o tecido de interesse deve ser fixado para preservar estruturas biológicas. A fixação funciona cruzando proteínas dentro das células. Para o ensaio TUNEL, os tecidos podem ser fixados adicionando-os a uma solução contendo 4% de paraformaldeído por 4-24 horas a 4°C. Após a fixação, criosection o tecido em fatias finas de 10 μm ou menos.

O próximo passo é a permeabilização, que permite que reagentes como a enzima TdT penetrem no núcleo celular. A permeabilização das seções teciduais pode ser realizada adicionando o tecido à solução proteinase K por 5-15 minutos a 37°C. Enxágüe seções de tecido com soro fisiológico tamponado em um agitador orbital por 15 a 30 minutos em temperatura ambiente.

Após a permeabilização, a enzima TdT e dUTPs fluorescentes são adicionados às seções teciduais, juntamente com um tampão de rotulagem contendo cobalto que atua como um cofator para a reação TUNEL. Juntas, a mistura de reação TUNEL e a seção de tecido são incubadas por 1-3 horas a 37°C, e protegidas da luz para evitar que a fluorescência desaje.

Após a incubação, o buffer stop é adicionado à seção de tecido para cessar a reação tunel, e após uma breve incubação as seções são lavadas com soro fisiológico tamponado de fosfato. Finalmente, as seções teciduais manchadas usando dUTP marcadas fluorescente são visualizadas por meio de microscopia de fluorescência e avaliadas para localização de células positivas tunel dentro de um determinado tecido. Pode-se quantificar a morte celular simplesmente contando a porcentagem de células positivas tunel em uma determinada seção tecidual.

Agora que você viu como executar o ensaio tunel para detectar células apoptóticas, vamos discutir como este ensaio pode ser usado para responder a perguntas feitas por biólogos celulares.

A morte celular ocorre como uma parte normal do desenvolvimento para a escultura de tecidos e estruturas, e para a eliminação de células desnecessárias. Portanto, cientistas interessados neste fenômeno estudam o efeito da exposição pré-natal a diferentes substâncias na apoptose durante o desenvolvimento. Aqui, os cientistas estavam interessados em examinar o efeito da exposição ao álcool pré-natal no desenvolvimento cerebral. Os resultados da coloração tunel realizada em cérebros fetais revelaram aumento da apoptose em tecidos que foram expostos pré-natal ao álcool, em comparação com os animais de controle.

Os cientistas também usam o ensaio TUNEL para investigar apoptose em resposta à infecção bacteriana. Neste experimento, os cientistas desenvolveram um modelo de pneumonia injetando camundongos com Pseudomonas aeruginosa, que induz inflamação pulmonar. Em seguida, o tecido pulmonar foi removido e a coloração tunel foi realizada para examinar apoptose em resposta à infecção bacteriana. Os resultados mostram que a morte de células apoptóticas aumentou em camundongos expostos às bactérias, em comparação com os animais de controle.

Por fim, a coloração TUNEL pode ser usada em amostras de tumores humanos, a fim de determinar a responsividade do tumor às drogas. Neste exemplo, amostras de tumores foram colhidas de pacientes humanos e ex vivo cultivadas. Em seguida, foram tratados com medicamentos pré-clínicos e avaliados para uma resposta utilizando o ensaio TUNEL. Dados obtidos mostram que o tratamento com uma droga que inibe a proteína de choque térmico 90 aumenta significativamente apoptose no tecido tumoral.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre o uso do ensaio TUNEL para detectar células submetidas à apoptose. Este vídeo revisou os princípios por trás da coloração tunel e um protocolo passo-a-passo para executar o ensaio TUNEL em seções de tecido. Também revisamos como esse método poderia ser aplicado para entender a morte celular programada durante o desenvolvimento e a doença. Como sempre, obrigado por assistir!

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