Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Cell Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

בדיקת הביולומינציה של ATP
 
Click here for the English version

בדיקת הביולומינציה של ATP

Overview

בגחליליות, האנזים לוציפראז ממיר תרכובת הנקראת לוציפרין לאוקסילוציפרין, ומייצר אור או "אור" כתוצאה מכך. תגובה זו דורשת אנרגיה הנגזרת ATP על מנת להמשיך, ולכן החוקרים ניצלו את אינטראקציית לוציפראז-לוציפרין כדי לאמוד את רמות ATP בתאים. בהתחשב בתפקידו של ATP כמטבע האנרגיה של התא, בדיקת הביולומינציה של ATP יכולה לספק תובנה על חילוף החומרים התאי ובריאות התא הכללית.

בסרטון זה, JoVE דן נשימה תאית, במיוחד סקירה כיצד חילוף החומרים גלוקוז תוצאות בייצור ATP. זה ואחריו עקרונות מאחורי בדיקת ביולומינציה ATP ופרוטוקול כללי לטכניקה זו. לבסוף, סקר של איך חוקרים משתמשים כיום בבדיקת ביולומינציה ATP כדי להעריך את הכדאיות של התא במגוון תנאים ניסיוניים.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בדיקת ביו-לומינציה ATP היא טכניקה נפוצה המשמשת לכימות רמות ATP ולזיהוי תאים חיים, פעילים מטבולית. ATP או אדנוסין טריפוספט הוא מקור האנרגיה העיקרי עבור כל האורגניזמים החיים, ועל ידי "הכל" אנחנו מתכוונים לכולם. ברמה התאית, ATP נוצר באמצעות קבוצה של תהליכים מטבוליים הנקראים נשימה תאית.

היום, נדון בקצרה במסלולים המעורבים בנשימה תאית. לאחר מכן, נציג את העקרונות מאחורי בדיקת הביולומינציה של ATP, ונעבור פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע שיטה זו. לבסוף, נראה כיצד מדענים מיישמים טכניקה זו במחקר הנוכחי שלהם.

נתחיל בהצגת נשימה תאית. תופעה זו כרוכה במספר תהליכים מטבוליים, אך נתמקד בזה העוסק בחילוף החומרים של הגלוקוז.

בציטופלזמה, מסלול הגליקוליזיס ממיר גלוקוז לפירובט, ותוך כדי כך מייצר שתי מולקולות ATP. Pyruvate מועבר לתוך המיטוכונדריה, שם הוא מומר אצטיל-קואנזים A - תהליך המייצר גם פחמן דו חמצני. בעוד עדיין במיטוכונדריה, אצטיל-קואנזים A ואז נכנס חומצה tricarboxylic או מחזור TCA, שבמהלכו פחמן דו חמצני נוצר שוב, כמו גם מולקולות אנרגיה גבוהה של NADH ו- FADH2. מולקולות אלה בסופו של דבר "לשאת" אלקטרונים לתוך שרשרת הובלת אלקטרונים או ETC.

בתוך ETC, אלקטרונים מועברים ברצף בין מתחמי חלבון שונים בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי, לפני המרת חמצן למים. במהלך תהליך זה, פרוטונים "נשאבים" לתוך החלל הבין-משרדי של המיטוכונדריה. ATP מיוצר למעשה כאשר פרוטונים אלה נכנסים בחזרה למטריקס המיטוכונדריאלי כשהם עוברים דרך חלבון הנקרא סינתאז ATP. יחד, מחזור TCA ו ETC לגרום לסינתזה של 36 מולקולות ATP. פירוק של מולקולות ממזון אחרות, כגון שומנים וחלבונים, יכול גם להאכיל לתוך מחזור TCA ETC, המוביל לייצור ATP.

עכשיו שאנחנו יודעים איך תאים מייצרים ATP, בואו נלמד על העקרונות שמאחורי בדיקת הביולומינציה של ATP, אשר משמשת בדרך כלל למדידת רמות תאיות של מולקולה זו.

מבחינה מבנית, ל-ATP יש בסיס אדנין, סוכר ריבוז ושלוש קבוצות פוספט – שהאחרון שבהם מחובר על ידי קשרים בעלי אנרגיה גבוהה. קשרים אלה משחררים אנרגיה כאשר הם נשברים, והבוחן הביולומינציה של ATP מנצל את האנרגיה הזו.

בעיקרון, בדיקה זו דורשת את תרכובת לוציפרין, אשר מתקבל אורגניזמים "זוהרים" כמו גחליליות, ואת אנזים הזרז המתאים שלה בשם לוציפראז. בנוכחות חמצן, לוציפראז מפיק אנרגיה מ- ATP וממיר לוציפרין לאוקסילוציפרין. תוצרי לוואי של תגובה זו הם pyrophosphate, שהוא שתי קבוצות פוספט המתקבלות מ- ATP - המרתו למונופוספט אדנוצין או AMP - פחמן דו חמצני, ואור או אור. זוהר נקרא על ידי לומינומטר, מכונה שמכומתת פליטת אור. מאז כמות luminescence המיוצר הוא פרופורציונלי ישירות לכמות ATP, זה משרת אינדיקטור טוב של הכדאיות התא ואת חילוף החומרים.

עכשיו שאתה מבין את העקרונות מאחורי בדיקת הביולומינציה של ATP, בואו נתווה פרוטוקול כללי.

ראשית, תאים נזרעים בלוח 96 באר המכיל מדיה תרבותית. תאים מצופים בצפיפות שונה במשולש, כדי להסביר וריאציה תלוית צפיפות. מכיוון שהבארות החיצוניות ביותר אינן מוקפות בבארות אחרות מכל ארבעת הצדדים, הטמפרטורה וקצב האידוי בבארות אלה עשויים להיות משתנים. לכן, תאים אינם מצופים בבארות החיצוניות, ובמקום זאת הם מלאים במים כדי למנוע אידוי רחב צלחת וריאציה בטמפרטורה שעשויה להשפיע על התגובה. לאחר מכן לוחות הם דגירה לילה ב 37°C כדי לאפשר לתאים לדבוק לוחות התרבות.

לאחר מכן, התקשורת מוסרת, לוציפראז ולוציפרין מתווספים לכל באר, ואת הצלחת ממוקמת על שייקר במשך 5-15 דקות כדי להקל על התגובה. לאחר מכן, חלק מהתערובת מכל באר מועבר לצלחת לבנה 96-well; לוחות לבנים משמשים לעתים קרובות כפי שהם משקפים אור כלפי מעלה, המאפשר קריאות זוהר מדויקות יותר. בנוסף, יש להימנע מבועות, שכן הן עלולות להפריע לנתחים הבאים. כמו אות luminescence יכול להקטין עם הזמן, הצלחת נקראת בתוך 10-12 דקות על לומינומטר.

כדי לנתח את תוצאות מד הזוהר, ערך אור ממוצע מחושב מבארות עם אותה צפיפות תאים. על ידי השוואת נתוני אור שנאספו באופן זה הן מדגימות בקרה בריאות והן מתאים מטופלים, החוקרים יכולים להעריך את ההשפעות של טיפול ספציפי על הכדאיות ועל חילוף החומרים – במיוחד על ידי חיפוש ירידה בצינוק בתאים בקבוצת הניסוי.

עכשיו שראיתם איך לבצע בדיקת ביו-לומינציה של ATP, בואו נדון ביישומי המחקר שלה.

מדענים תמיד מנסים לפתח תרופות אנטי-ויראליות חדשות שלא פוגעות או הורגות תאים מארחים. במחקר זה, תאי יונקים נזרעו בצלחת רב-וול ונדבקו בנגיף מסוים. תרכובות אנטי ויראליות שונות נוספו דגימות אלה, עקומות ריכוז-תגובה יומן נוצרו כדי לחשב את הריכוז האפקטיבי חמישים או EC50. EC50 הוא הריכוז של תרכובת שבה הכדאיות התא היא 50 אחוז. זהו פרמטר נפוץ להערכת ציטוטוקסיות של תרכובת.

רמות ATP יכולות גם להניב רמזים על פעילות מיטוכונדריאלית בתנאים שונים. כאן, בדיקת ביולומינציה ATP בוצעה על תכשירים של המיטוכונדריה נגזר כבד מכרסמים ותאי שריר, אשר סייע לחוקרים להעריך את מידת התפקוד המיטוכונדריאלי ברקמות נורמליות. חשוב לציין, פרוטוקול זה יכול להיות מורחב כדי לספק דרך לבחון את התפקוד המיטוכונדריאלי במצבי מחלה.

מדענים משתמשים גם בחקירה זו כדי לחקור טיפולים פוטנציאליים לסרטן במערכות ויוו. בדוגמה זו, תאים סרטניים אנושיים שונו כדי לבטא לוציפראז והוזרקו למוחם של עכברים חיים. לאחר שתאי הגידול התבססו בבעלי חיים אלה, הם טופלו בתרופה נגד סרטן. בדיקה ביו-לומינציה מאוחרת יותר של vivo ATP גילתה כי לתאי הגידול בעכברים החשופים לתרופות היו רמות ATP נמוכות יותר.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לתפילה ביו-לומינציה של אי.טי.פי. עכשיו אתה צריך להכיר את מסלולי הנשימה התאית ואת הפרוטוקול המשמש למדידת ATP, שהוא התוצר הסופי של מסלולים אלה. בדיקת ביולומינציה ATP משמשת ככלי סינון מצוין עבור ביולוגים תאים המעוניינים לחקור את ההשפעה של גורמים פיזיולוגיים ופתולוגיים על חילוף החומרים של התאים ואת הכדאיות. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter