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Il saggio di bioluminescenza ATP

Overview

Nelle lucciole, l'enzima luciferasi converte un composto chiamato luciferina in ossiluciferina e produce luce o "luminescenza" di conseguenza. Questa reazione richiede energia derivata dall'ATP per procedere, quindi i ricercatori hanno sfruttato l'interazione luciferasi-luciferina per misurare i livelli di ATP nelle cellule. Dato il ruolo dell'ATP come valuta energetica della cellula, il test di bioluminescenza dell'ATP può fornire informazioni sul metabolismo cellulare e sulla salute generale delle cellule.

In questo video, JoVE discute la respirazione cellulare, in particolare esaminando come il metabolismo del glucosio provoca la produzione di ATP. Questo è seguito dai principi alla base del test di bioluminescenza ATP e da un protocollo generalizzato per questa tecnica. Infine, un'indagine su come i ricercatori stanno attualmente utilizzando il test di bioluminescenza ATP per valutare la vitalità cellulare in una varietà di condizioni sperimentali.

Procedure

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Il test di bioluminescenza ATP è una tecnica comune utilizzata per quantificare i livelli di ATP e rilevare cellule viventi metabolicamente attive. L'ATP o adenosina trifosfato è la fonte primaria di energia per tutti gli organismi viventi, e per "tutti" intendiamo TUTTI. A livello cellulare, l'ATP viene generato attraverso una serie di processi metabolici chiamati respirazione cellulare.

Oggi discuteremo brevemente i percorsi coinvolti nella respirazione cellulare. Successivamente, introdurremo i principi alla base del test di bioluminescenza ATP e passeremo attraverso un protocollo passo-passo per eseguire questo metodo. Infine, vedremo come gli scienziati stanno applicando questa tecnica nella loro attuale ricerca.

Iniziamo introducendo la respirazione cellulare. Questo fenomeno coinvolge diversi processi metabolici, ma ci concentreremo su quello che si occupa del metabolismo del glucosio.

Nel citoplasma, la via della glicolisi converte il glucosio in piruvato e nel processo genera due molecole di ATP. Il piruvato viene trasportato nei mitocondri, dove viene convertito in acetil-coenzima A, un processo che genera anche anidride carbonica. Mentre è ancora nei mitocondri, l'acetil-coenzima A entra quindi nel ciclo dell'acido tricarbossilico o TCA, durante il quale viene nuovamente generata anidride carbonica, così come le molecole ad alta energia di NADH e FADH2. Queste molecole alla fine "trasportano" gli elettroni nella catena di trasporto degli elettroni o ETC.

All'interno dell'ETC, gli elettroni vengono trasferiti sequenzialmente tra diversi complessi proteici nella membrana mitocondriale interna, prima di convertire l'ossigeno in acqua. Durante questo processo, i protoni vengono "pompati" nello spazio intermembrana dei mitocondri. L'ATP viene effettivamente prodotto quando questi protoni rientrano nella matrice mitocondriale mentre passano attraverso una proteina chiamata ATP sintasi. Insieme, il ciclo TCA e l'ETC si traducono nella sintesi di 36 molecole di ATP. La scomposizione di altre molecole nutritive, come grassi e proteine, può anche alimentare il ciclo TCA e ETC, portando alla produzione di ATP.

Ora che sappiamo come le cellule generano ATP, impariamo a conoscere i principi alla base del test di bioluminescenza ATP, che è comunemente usato per misurare i livelli intracellulari di questa molecola.

Strutturalmente, l'ATP ha una base di adenina, uno zucchero ribosio e tre gruppi fosfato, l'ultimo dei quali è collegato da legami ad alta energia. Questi legami rilasciano energia quando si rompono e il test di bioluminescenza ATP capitalizza su questa energia.

Fondamentalmente, questo test richiede il composto luciferina, che è ottenuto da organismi "incandescenti" come le lucciole, e il suo corrispondente enzima catalizzatore chiamato luciferasi. In presenza di ossigeno, la luciferasi ricava energia dall'ATP e converte la luciferina in ossiluciferina. I sottoprodotti di questa reazione sono il pirofosfato, che è due gruppi fosfato ottenuti dall'ATP, convertendolo in adenosina monofosfato o AMP, anidride carbonica, e luce o luminescenza. La luminescenza viene letta da un luminometro, una macchina che quantifica l'emissione luminosa. Poiché la quantità di luminescenza prodotta è direttamente proporzionale alla quantità di ATP, questo serve un buon indicatore della vitalità cellulare e del metabolismo.

Ora che hai compreso i principi alla base del test di bioluminescenza ATP, descriviamo un protocollo generale.

In primo luogo, le cellule vengono seminate in una piastra a 96 pozzetti contenente mezzi di coltura. Le cellule sono placcate a varie densità in triplice copia, per tenere conto della variazione dipendente dalla densità. Poiché i pozzi più esterni non sono circondati da altri pozzi su tutti e quattro i lati, la temperatura e il tasso di evaporazione in questi pozzi possono essere variabili. Pertanto, le celle non sono placcate nei pozzi esterni, ma sono invece riempite d'acqua per evitare l'evaporazione a livello di piastra e la variazione di temperatura che possono influenzare la reazione. Le piastre vengono quindi incubate durante la notte a 37 ° C per consentire alle cellule di aderire alle piastre di coltura.

Quindi, il supporto viene rimosso, la luciferasi e la luciferina vengono aggiunte a ciascun pozzetti e la piastra viene posta su uno shaker per 5-15 minuti per facilitare la reazione. Successivamente, una parte della miscela da ciascun pozzo viene trasferita in una piastra bianca a 96 pozzetti; le piastre bianche sono spesso utilizzate in quanto riflettono la luce verso l'alto, consentendo letture di luminescenza più accurate. Inoltre, le bolle dovrebbero essere evitate, in quanto potrebbero interferire con le analisi successive. Poiché il segnale di luminescenza può diminuire nel tempo, la piastra viene letta entro 10-12 minuti su un luminometro.

Per analizzare i risultati del luminometro, viene calcolato un valore medio di luminescenza da pozzi con la stessa densità cellulare. Confrontando i dati di luminescenza raccolti in questo modo sia da campioni di controllo sani che da cellule trattate, i ricercatori possono valutare gli effetti di un trattamento specifico sulla vitalità e sul metabolismo, in particolare cercando una diminuzione della luminescenza nel gruppo sperimentale.

Ora che hai visto come eseguire un test di bioluminescenza ATP, discutiamo le sue applicazioni di ricerca.

Gli scienziati cercano sempre di sviluppare nuovi antivirali che non danneggino o uccidano le cellule ospiti. In questo studio, le cellule di mammifero sono state seminate in una piastra multiwell e infettate da un virus specifico. A questi campioni sono stati aggiunti vari composti antivirali e sono state generate curve concentrazione-risposta per calcolare la concentrazione effettiva cinquanta o EC50. EC50 è la concentrazione di composto alla quale la vitalità cellulare è del 50 percento. Questo è un parametro comunemente usato per valutare la citotossicità di un composto.

I livelli di ATP possono anche fornire indizi sull'attività mitocondriale in varie condizioni. Qui, il test di bioluminescenza ATP è stato eseguito su preparati di mitocondri derivati da cellule epatiche e muscolari di roditori, che hanno aiutato i ricercatori a valutare l'estensione della funzione mitocondriale nei tessuti normali. È importante sottolineare che questo protocollo potrebbe essere esteso per fornire un modo per esaminare la funzione mitocondriale negli stati patologici.

Gli scienziati stanno anche usando questo test per studiare potenziali trattamenti contro il cancro in sistemi in vivo. In questo esempio, le cellule tumorali umane sono state modificate per esprimere la luciferasi e iniettate nel cervello di topi viventi. Dopo che le cellule tumorali si sono stabilite in questi animali, sono state trattate con un farmaco anti-cancro. Un successivo test di bioluminescenza ATP in vivo ha rivelato che le cellule tumorali nei topi esposti al farmaco avevano livelli di ATP più bassi.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE al test di bioluminescenza ATP. Ora dovresti avere familiarità con le vie respiratorie cellulari e il protocollo utilizzato per misurare l'ATP, che è il prodotto finale di questi percorsi. Il test di bioluminescenza ATP funge da eccellente strumento di screening per i biologi cellulari interessati a studiare l'effetto di fattori fisiologici e patologici sul metabolismo cellulare e sulla vitalità. Come sempre, grazie per aver guardato!

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