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ATP 생물 발광 분석

Overview

반딧불이에서, 루시파라제 효소는 루시페린에게 불린 화합물을 옥시루시페린으로 변환하고, 그 결과로 빛 또는 "발광"을 생성합니다. 이 반응은 진행하기 위하여 ATP에서 파생된 에너지를 요구합니다, 그래서 연구원은 세포에 있는 ATP 수준을 측정하기 위하여 luciferase-luciferin 상호 작용을 이용했습니다. ATP가 세포의 에너지 화폐로서의 역할을 감안할 때 ATP 생물 발광 분석은 세포 대사및 전반적인 세포 건강에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이 비디오에서 JoVE는 세포 호흡에 대해 논의하며, 특히 포도당 대사가 ATP 생산에서 어떻게 발생하는지 검토합니다. 이것은 ATP 생물 발광 분석의 뒤에 원리 및 이 기술에 대한 일반화된 프로토콜에 선행됩니다. 마지막으로, 연구원은 현재 다양한 실험 조건에서 세포 생존가능성을 평가하기 위해 ATP 생물 발광 분석법을 사용하는 방법에 대한 설문 조사.

Procedure

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ATP 생물 발광 분석법은 ATP 수준을 정량화하고 살아있는, 신진 대사 활성 세포를 검출하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다. ATP 또는 아데노신 트리호스페이트(adenosine triphosphate)는 모든 생물의 에너지원천이며, "모두"로 우리는 모두를 의미합니다. 세포 수준에서, ATP는 세포 호흡에게 불린 신진 대사 프로세스의 세트를 통해 생성됩니다.

오늘, 우리는 간략하게 세포 호흡에 관련된 통로를 토론할 것입니다. 다음으로 ATP 생물 발광 분석의 원리를 소개하고 이 방법을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 살펴보겠습니다. 마지막으로, 우리는 과학자들이 현재 연구에서이 기술을 적용하는 방법을 볼 수 있습니다.

세포 호흡을 도입하여 시작할 수 있습니다. 이 현상은 몇몇 신진 대사 과정을 관련시킵니다, 그러나 우리는 포도당 물질 대사를 취급하는 하나에 집중할 것입니다.

세포질에서, 글리코리시스 통로는 포도당을 피루바테로 변환하고, 그 과정에서 2개의 ATP 분자를 생성합니다. 피루바테는 미토콘드리아로 이송되어 이산화탄소를 생성하는 아세틸 코엔자임 A로 변환됩니다. 미토콘드리아에 있는 동안, 아세틸 코엔자임 A는 그 때 이산화탄소가 다시 생성되는 동안, NADH와 FADH2의 고에너지 분자와 같이, 트리카복실산 또는 TCA 주기를 입력합니다. 이 분자는 궁극적으로 전자 수송 사슬 또는 ETC로 전자를 "운반"합니다.

ETC 내에서 전자는 산소를 물로 변환하기 전에 내부 미토콘드리아 막의 다른 단백질 복합체 간에 순차적으로 전달됩니다. 이 과정에서 양성자는 미토콘드리아의 막 간 공간으로 "펌핑"됩니다. ATP는 실제로 이 양성자가 ATP synthase에게 불린 단백질을 통과할 때 미토콘드리아 매트릭스로 다시 들어갈 때 생성됩니다. 함께, TCA 주기 및 ETC는 36 ATP 분자의 합성귀착됩니다. 지방과 단백질과 같은 다른 영양소 분자의 분해는 또한 TCA 주기 및 ETC로 공급하여 ATP 생산으로 이어질 수 있습니다.

이제 세포가 ATP를 생성하는 방법을 알고 있으므로 이 분자의 세포 내 수준을 측정하는 데 일반적으로 사용되는 ATP 생물 발광 분석의 원리에 대해 알아 봅시다.

구조적으로 ATP에는 아데닌 베이스, 리보오스 설탕 및 3개의 인산염 그룹이 있으며, 그 중 후자는 고에너지 결합으로 연결됩니다. 이 채권은 파손될 때 에너지를 방출하며 ATP 생물 발광 분석은 이 에너지를 활용합니다.

기본적으로, 이 분석은 반딧불과 같은 "빛나는"유기체에서 얻어지는 루시퍼린 화합물, 그리고 루시파라제라는 해당 촉매 효소를 요구합니다. 산소의 존재에서, 루시파라제는 ATP에서 에너지를 파생하고 옥시 루시페린으로 루시페린을 변환합니다. 이 반응의 부산물은 ATP에서 얻은 두 개의 인산염 그룹으로, 아데노신 모노인산염 또는 AMP-이산화탄소, 빛 또는 발광으로 변환합니다. 발광은 광 방출을 정량화하는 기계인 광미계에 의해 읽습니다. 생산된 발광의 양은 ATP의 양에 직접적으로 비례하기 때문에, 이것은 세포 생존가능성과 신진대사의 좋은 지표를 제공합니다.

이제 ATP 생물 발광 분석의 원리를 이해하게 되었으므로 일반 프로토콜을 설명해 보겠습니다.

첫째, 세포는 배양 배지를 포함하는 96웰 플레이트에서 시드된다. 세포는 밀도 의존적 변동을 고려하여 삼중기판의 다양한 밀도에서 도금됩니다. 외투성 우물은 사측의 다른 우물에 둘러싸여 있지 않기 때문에, 이들 우물의 온도및 증발속도는 변태일 수 있다. 따라서, 세포는 외부 우물에서 도금되지 않으며, 대신 반응에 영향을 미칠 수 있는 판전체 증발 및 온도 변동을 피하기 위해 물로 채워져 있습니다. 플레이트는 세포가 배양 판에 부착할 수 있도록 37°C에서 하룻밤 사이에 배양됩니다.

이어서, 매체가 제거되고, 루시파라제와 루시퍼린이 각각 양에 첨가되고, 플레이트는 반응을 용이하게 하기 위해 5-15분 동안 셰이커에 놓입니다. 다음으로, 각 웰에서 혼합물의 일부가 흰색 96웰 플레이트로 전달된다; 백색 플레이트는 빛을 위쪽으로 반사하여 보다 정확한 발광 판독값을 허용하므로 종종 사용됩니다. 또한, 거품은 후속 분석을 방해할 수 있기 때문에 피해야 합니다. 발광 신호가 시간이 지남에 따라 감소할 수 있기 때문에 플레이트는 광미계에서 10-12분 이내에 판독됩니다.

발광계 결과를 분석하기 위해, 평균 발광 값은 동일한 세포 밀도를 가진 우물에서 계산됩니다. 건강한 대조군 샘플과 처리된 세포 모두에서 이러한 방식으로 수집된 발광 데이터를 비교하여, 연구원은 특히 실험 군에서 발광 감소를 찾아서 생존력과 신진 대사에 대한 특정 치료의 효과를 평가할 수 있습니다.

이제 ATP 생물 발광 분석법을 수행하는 방법을 보았으니 연구 응용 분야에 대해 논의해 보겠습니다.

과학자들은 항상 호스트 세포를 해치거나 죽이지 않는 새로운 항 바이러스를 개발하기 위해 노력하고 있습니다. 이 연구에서, 포유류 세포는 다중 웰 플레이트에서 종자 하 고 특정 바이러스에 감염 되었다. 이들 샘플에 다양한 항바이러스 화합물을 첨가하였고, 로그 농도 반응 곡선이 생성되어 유효 농도 50 또는 EC50을 계산하였다. EC50은 세포 생존능력이 50%인 화합물의 농도이다. 이것은 화합물의 세포 독성을 평가 하기 위해 일반적으로 사용 되는 매개 변수.

ATP 수준은 또한 각종 조건하에서 미토콘드리아 활동에 관하여 단서를 산출할 수 있습니다. 여기서 ATP 생체 발광 분석은 설치류 간 및 근육 세포에서 파생된 미토콘드리아의 제제에 수행되었으며, 이는 연구원이 정상 조직에서 미토콘드리아 기능의 정도를 평가하는 데 도움이 되었습니다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 질병 국가에 있는 미토콘드리아 기능을 검토하는 쪽을 제공하기 위하여 확장될 수 있었습니다.

과학자는 또한 생체 내 시스템에서 잠재적인 암 처리를 조사하기 위하여 이 분석기를 사용하고 있습니다. 이 예에서, 인간 종양 세포는 루시파아제를 발현하도록 변형되고 살아있는 마우스의 뇌에 주입되었다. 종양 세포가 이 동물에서 확립된 후에, 그(것)들은 항암약으로 취급되었습니다. 생체 ATP 생물 발광 분석결과 약물 노출 마우스의 종양 세포가 ATP 수치가 낮았다는 사실이 밝혀졌습니다.

당신은 방금 ATP 생물 발광 분석에 JoVE의 소개를 보았다. 이제 세포 호흡 경로와 ATP를 측정하는 데 사용되는 프로토콜에 익숙해져야하며, 이는 이러한 경로의 최종 제품입니다. ATP 생물 발광 분석은 세포 대사 및 생존가능성에 생리적이고 병리학적인 요인의 효과를 연구하는 데 관심이있는 세포 생물학자를위한 우수한 선별 도구 역할을합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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