Overview
Le specie reattive dell'ossigeno sono molecole chimicamente attive, derivate dall'ossigeno, in grado di ossidare altre molecole. A causa della loro natura reattiva, ci sono molti effetti deleteri associati alla produzione incontrollata di ROS, compresi i danni strutturali al DNA e ad altre molecole biologiche. Tuttavia, i ROS possono anche essere mediatori della segnalazione fisiologica. Ci sono prove accumulate che i ROS svolgono ruoli significativi in tutto, dall'attivazione dei fattori di trascrizione alla mediazione della tossicità infiammatoria che uccide i patogeni estranei e difende il corpo.
In questo video approfondiremo le associazioni tra ROS, metabolismo e malattia. Dopo aver stabilito il loro significato, discuteremo i principi e un protocollo di una metodologia comunemente usata per misurare i livelli di ROS nelle cellule: l'uso di sonde non fluorescenti che diventano fluorescenti dopo l'ossidazione. Infine, esamineremo alcune applicazioni attuali di questa tecnica nella ricerca sulla biologia cellulare.
Procedure
Le specie reattive dell'ossigeno prodotte nelle cellule sono state implicate nell'omeostasi dei tessuti, nell'invecchiamento cellulare e in stati patologici come il cancro. Come suggerisce il nome, queste molecole derivano dall'ossigeno, che esiste naturalmente come una molecola stabile e diossigena poiché tutti i suoi elettroni sono accoppiati. L'aggiunta di un elettrone spaiato lo rende instabile e porta alla formazione dell'anione superossido, una forma di specie reattive dell'ossigeno o ROS. Oltre all'anione superossido, ci sono diversi tipi di specie reattive con elettroni spaiati, i cui livelli la cellula mira a controllare strettamente.
In questo video, impareremo come le specie reattive dell'ossigeno sono correlate al metabolismo cellulare e alle malattie, esploreremo i principi alla base di un test per la sua rilevazione utilizzando una sonda fluorescente e esamineremo un protocollo generalizzato per questo test. Infine, studieremo come gli scienziati stanno implementando questo metodo negli esperimenti di oggi.
Per prima cosa, discutiamo di come vengono prodotte le specie reattive dell'ossigeno e consideriamo la loro influenza nel metabolismo cellulare e nelle malattie.
Una fonte significativa di specie reattive dell'ossigeno cellulare sono i mitocondri. Normalmente, durante il metabolismo cellulare gli elettroni vengono trasportati attraverso una catena di complessi proteici, culminando nella riduzione dell'ossigeno molecolare in acqua e nella generazione simultanea di ATP. Nonostante la straordinaria regolazione di questo processo, gli elettroni fuoriescono, con conseguente formazione di anione superossido.
La presenza di anione superossido dà rapidamente origine ad altre forme di specie reattive dell'ossigeno, come il perossido di idrogeno e il radicale idrossile. Questi radicali, che possiedono tutti un elettrone spaiato altamente reattivo, possono danneggiare ossidativamente membrane, DNA e proteine. Per contrastare, la cellula mantiene la propria scorta antiossidante di enzimi come la superossido dismutasi, o molecole come la vitamina C, che riducono i radicali liberi. Qualsiasi squilibrio in questo sistema di difesa può provocare un ciclo di feedback positivo potenzialmente fatale, con conseguente condizione di eccessiva specie reattiva dell'ossigeno nota come stress ossidativo.
Le specie reattive dell'ossigeno sono state implicate nell'inizio e nella progressione del cancro. Un altro effetto dannoso di queste molecole è l'induzione dell'invecchiamento cellulare, noto anche come senescenza. La "Teoria dei radicali liberi dell'invecchiamento" propone che le specie reattive dell'ossigeno prodotte nelle cellule durante il normale metabolismo evochino la senescenza cellulare e la morte.
Fino ad ora, abbiamo discusso gli aspetti negativi di queste molecole altamente reattive, ma hanno anche ruoli positivi nella fisiologia cellulare. Durante le risposte immunitarie quando i fagociti inghiottono i patogeni, le cellule montano un "scoppio respiratorio" durante il quale vengono generate quantità eccessive di specie reattive dell'ossigeno per degradare ossidativamente i patogeni. Inoltre, sono intermedi e regolatori necessari di una varietà di percorsi di segnalazione cellulare e possono persino segnalare la morte di cellule che sono diventate cancerose.
Per quantificare questi influenti ossidanti cellulari, gli scienziati sfruttano molecole che all'ossidazione diventano fluorescenti. Una sonda comunemente usata per rilevare le specie reattive dell'ossigeno è H2DCFDA o dicloro-diidro-fluoresceina diacetato, un analogo non fluorescente della fluoresceina. Quando aggiunto alle cellule, la sua natura permeante cellulare gli consente di diffondersi passivamente.
Quindi, le esterasi intracellulari catalizzano una reazione di idrolisi, che si traduce nella scissione dei gruppi di acetato. Questo rende il composto più polare, in modo che venga trattenuto all'interno della cellula. Dopo l'ossidazione, che comporta la rimozione di atomi di idrogeno da parte di una vasta gamma di specie reattive dell'ossigeno, l'H2DCFDA non fluorescente viene convertito nella dicloro-fluoresceina altamente fluorescente, o DCF. Questo può essere letto e quantificato da un lettore di piastre, citometro a flusso o microscopia a fluorescenza.
Ora che sai come funziona questo test, vediamo come viene eseguito in un ambiente di laboratorio.
Inizia trasferendo le cellule cresciute in terreno di coltura alla soluzione salina tamponata con fosfato, seguita dalla centrifugazione per lavarle. Rimuovere il surnatante e aggiungere la soluzione di sonda fluorescente H2DCFDA. Incubare le celle caricate con colorante al buio per prevenire il fotosableching. Dopo l'incubazione, lavare le cellule per rimuovere il colorante scaricato e trasferire le cellule su una piastra. A questo punto, possono essere aggiunti induttori sperimentali dello stress ossidativo.
Quando sono pronte per l'analisi, le celle possono essere inserite nel lettore di lastre. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sono impostate per la fluoresceina. Dopo aver letto le piastre, i valori possono essere analizzati. I risultati rivelano la quantità relativa di specie reattive dell'ossigeno tra i campioni in particolari punti temporali.
Ora che abbiamo esaminato il protocollo effettivo, diamo un'occhiata a come viene applicato negli esperimenti di oggi.
I ricercatori usano spesso questo metodo per studiare la meccanica della fagocitosi. Questo gruppo di scienziati voleva studiare la capacità del pesce zebra di montare una risposta immunitaria in diverse fasi di sviluppo. Come accennato in precedenza, la fagocitosi provoca la generazione di specie ad alto contenuto di ossigeno reattivo, o "uno scoppio respiratorio", che viene utilizzato per uccidere gli agenti patogeni. Poiché l'enzima NADPH ossidasi è un significativo produttore di ROS nelle cellule fagocitiche, questi scienziati hanno indotto la risposta allo scoppio trattando il pesce zebra con un induttore NADPH. I risultati hanno dimostrato che tra gli embrioni di zebrafish la cui risposta "scoppiata" era stata provocata, quelli a 72 ore dopo la fecondazione mostravano uno sviluppo di specie reattive dell'ossigeno più elevato rispetto a quelli a 48 ore dopo la fecondazione.
La disfunzione mitocondriale dovuta all'aumento delle specie reattive dell'ossigeno è una caratteristica patologica di molte malattie. Pertanto, i ricercatori possono identificare la disfunzione mitocondriale misurando il livello di stress ossidativo. Qui, gli scienziati hanno caricato H2DCFDA sui neuroni e poi hanno montato i campioni su un microscopio a fluorescenza. Con l'aggiunta di un fattore di stress ossidativo, come il perossido di idrogeno, i corpi cellulari hanno mostrato un improvviso aumento della fluorescenza, che potrebbe essere un'indicazione di disfunzione mitocondriale.
Gli astrociti sono stati suggeriti per proteggere i neuroni del sistema nervoso centrale dallo stress ossidativo. A causa di questo significato, questi ricercatori miravano a sviluppare un test per rilevare lo stress ossidativo negli astrociti in presenza di un induttore esterno. Lo hanno fatto incubando astrociti con perossido di idrogeno e la sonda fluorescente per il rilevamento di specie reattive dell'ossigeno. La successiva fluorescenza generata è stata analizzata utilizzando un citometro a flusso. Gli astrociti attivati per lo stress ossidativo sono stati osservati cadere all'interno di una regione di maggiore intensità di fluorescenza, vista spostata a destra.
Hai appena visto il video di JoVE sul rilevamento di specie reattive dell'ossigeno o ROS. Per riassumere, in questo video abbiamo discusso il legame tra specie reattive dell'ossigeno, metabolismo cellulare e malattie. Abbiamo quindi esaminato il principio e la procedura di un test per il rilevamento di specie reattive dell'ossigeno. Infine, abbiamo esplorato come i ricercatori stanno applicando questo metodo alle loro indagini. L'analisi dei ruoli ancora enigmatici delle specie reattive dell'ossigeno è di grande interesse per i biologi cellulari e la misurazione affidabile con sonde fluorescenti si sta rivelando inestimabile. Come sempre, grazie per aver guardato!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
