Overview
מקור: המעבדה של ד"ר אנדרו ג'יי סטקל — אוניברסיטת סינסינטי
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, או SEM, הוא מיקרוסקופ רב עוצמה המשתמש באלקטרונים כדי ליצור תמונה. זה מאפשר הדמיה של דגימות מוליכות בהגדלות שלא ניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופים מסורתיים. מיקרוסקופי אור מודרניים יכולים להשיג הגדלה של ~1,000X, בעוד SEM טיפוסי יכול להגיע להגדלות של יותר מ-30,000X. מכיוון שה- SEM אינו משתמש באור כדי ליצור תמונות, התמונות המתקבלות שהוא יוצר הן בשחור-לבן.
דגימות מוליכות נטענות על שלב הדגימה של ה- SEM. ברגע שתא הדגימה יגיע לוואקום, המשתמש ימשיך ליישר את אקדח האלקטרונים במערכת למיקום הנכון. אקדח האלקטרונים יורה קרן של אלקטרונים בעלי אנרגיה גבוהה, אשר נעים דרך שילוב של עדשות וצמצמים ובסופו של דבר פוגעים במדגם. בעוד אקדח האלקטרונים ממשיך לירות אלקטרונים במיקום מדויק על המדגם, אלקטרונים משניים יקפצו מהדגימה. האלקטרונים המשניים האלה מזוהים על ידי הגלאי. האות שנמצא מהאלקטרונים המשניים מוגבר ונשלח לצג, ויוצר תמונה תלת-ממדית. וידאו זה יציג יכולות הכנה, פעולה והדמיה של מדגם SEM.
Principles
אלקטרונים נוצרים על ידי חימום על ידי אקדח האלקטרונים, הפועל כמו קתודה. אלקטרונים אלה נדחפים לכיוון האנודה, באותו כיוון כמו המדגם, בשל שדה חשמלי חזק. לאחר קרן האלקטרונים מרוכזת, היא נכנסת לעדשה האובייקטיבית, אשר מכוילת על ידי המשתמש למיקום קבוע על המדגם. (איור 1)
ברגע שהאלקטרונים פוגעים במדגם מוליך, שני דברים יכולים לקרות. ראשית, האלקטרונים העיקריים שפגעו במדגם יתחפרו דרכה לעומק התלוי ברמת האנרגיה של האלקטרונים האלה. לאחר מכן, האלקטרונים המשניים והמתכווצים יפגעו במדגם וישקפו כלפי חוץ ממנה. אלקטרונים משתקף אלה נמדדים לאחר מכן על ידי גלאי האלקטרונים המשני (SE) או backscattered (BS). לאחר עיבוד האות מתרחש, תמונה של המדגם נוצרת על המסך. 1
במצב SE, אלקטרונים משניים נמשכים על ידי הטיה חיובית בחזית הגלאי בגלל האנרגיה הנמוכה שלהם. עוצמת האות מגוונת בהתאם לזווית המדגם. לכן, מצב SE מספק תמונות טופוגרפיות מאוד. מצד שני, במצב BS, כיוון האלקטרונים הוא כמעט הפוך כמעט בכיוון הקרן האלקטרונית ועוצמת הזיהוי פרופורציונלית למספר האטומי של המדגם. לכן, זה פחות טופוגרפי, אבל שימושי עבור תמונות קומפוזיציה. מצב BS מושפע פחות גם מהשפעת הטעינה על המדגם, אשר מועיל עבור דגימות שאינן מוליכות. 1
איור 1. סכמטי של SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. הכנת המדגם
- מניחים דגימה על ספח דגימה. במידת הצורך, סרט פחמן עשוי לשמש כדי דבק קשר המדגם לספח.
- מניחים את הדגימה לתוך מערכת מקרטעת זהב. באמצעות מקרטעת מיני-זהב, זהב מקרטעת עבור 30 s ב ~ 70 mTorr לחץ. עובי שכבת זהב שונה עשוי להיות נחוץ בהתאם לגיאומטריה של המדגם. משטח מחוספס או נקבובי יותר דורש זמן ארוך יותר.
- הסר ספח ממערכת מקרטעת זהב.
2. הוספה לדוגמה וההפעלה של SEM
- לפרוק את תא SEM, המאפשר לתא להגיע ללחץ נומינלי.
- פתח את תא הדגימה של SEM והוציא את שלב הדגימה.
- הכנס את ספח הדגימה המכיל את המדגם על הבמה. הדקו את הספח למקומו.
- אם לא ניתן לשלוט במרחק z על-ידי תוכנה, ודא שלב הדגימה עם ספח דגימה יש גובה מתאים כדי לקבל את התמונה טובה יותר.
- שים את שלב הדגימה בתא הדגימה. סגור את תא הדגימה.
- הפעל את המשאבות ואפשר למערכת להגיע לוואקום. המערכת תודיע למשתמש עם השלמת פעולה זו.
- פתח את תוכנת SEM. בחר מתח הפעלה רצוי הנע בין 1-30 kV. מתח הפעלה גבוה יותר מעניק ניגודיות תמונה טובה יותר, אך יכול להניב רזולוציה נמוכה יותר אם חיובים מצטברים במדגם.
3. לכידת תמונת ה-SEM
- התחל 'מיקוד אוטומטי' בתוכנת SEM על-ידי לחיצה על סמל המפתח. פעולה זו תרכוש תמונה ממוקדת של המדגם לשימוש כנקודת התחלה.
- ודא שההגדלה מוגדרת לרמת הזום המינימלית של פי 50.
- בחר במצב 'סריקה מהירה'.
- התאם את המוקד במצב גס עד להשגת מיקוד גס.
- התאם את הבמה באופן ידני באמצעות הכפתורים החיצוניים כך שאזור העניין יהיה גלוי בתצוגה.
- הגדל את רמת ההגדלה עד לצפייה בתכונה הרצויה. התאימו את ידית המיקוד הגסה כדי למקד בערך את התמונה בהגדלה זו. לאחר מכן, שפר את המוקד באמצעות ידית המיקוד העדינות כדי לקבל תמונה ממוקדת ברמת ההגדלה הרצויה. שלב זה יחזור על עצמו בכל פעם שרמת ההגדלה תוגדל.
- לאחר הגעת ההגדלה הרצויה, התאימו את ידית המיקוד העדינות כדי לשפר את הבהירות.
- למיטוב בהירות התמונה, הגדל את ההגדלה קרוב לרמה המרבית ולאחר מכן מקד את התמונה באמצעות ידית המיקוד העדינות. אם לא ניתן להשיג תמונה ברורה, התאם את הסטיגמה הן בכיוון x והן בכיוון y. המשך להתאים את המיקוד והסטיגמות עד לקבלת התמונה הברורה ביותר ברמת ההגדלה המוגזמת.
- לאחר הגעה לתמונת איכות של המדגם, חזור לרמת ההגדלה הרצויה. ניתן לצלם את התמונה על-ידי לחיצה על לחצן התמונה במצב 'תמונה איטית' או 'תמונה מהירה'. מצב 'תמונה איטית' מעניק איכות טובה יותר ורזולוציה גבוהה יותר של התמונה.
4. ביצוע מדידות באמצעות תוכנת SEM
- ברשימה הנפתחת 'חלוניות', בחר 'כלים מ'.
- ניתן למדוד מידות שונות כגון אורך, שטח וזווית ישירות בתוכנת SEM. כדי לבצע אחת מהמדידות הללו, לחץ על הסמל הרצוי בחלון M. Tools.
- גלול אל אתר המדידה בתמונת SEM. המדידות נעשות על ידי לחיצה על התמונה כדי ליצור נקודות התייחסות שינותחו על ידי התוכנה. ניתן להוסיף נקודות נתונים שנמדדו ישירות לתמונה אם המשתמש רוצה בכך.
- לאחר מכן נשמרות תמונות במחשב.
סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים, או SEM, היא טכניקה רבת עוצמה המשמשת בכימיה וניתוח חומרים המשתמשת בקרן אלקטרונים סרוקה כדי לנתח את מבנה פני השטח וההרכב הכימי של מדגם.
מיקרוסקופי אור מודרניים מוגבלים על ידי האינטראקציה של גלי אור נראים עם אובייקט, הנקרא עקיפה. המרחק הניתן לפתרון הקטן ביותר בין שני אובייקטים, או הרזולוציה לרוחב, משתנה בהתאם לגודל תבנית ההפרשה בהשוואה לגודל האובייקט. כתוצאה מכך, מיקרוסקופים אור יש הגדלה מקסימלית של עד 1,000X ורזולוציה לרוחב של עד 200 ננומטר במצבים אידיאליים.
SEM אינו מוגבל על ידי עקיפה, שכן הוא משתמש בקרן אלקטרונים ולא באור. לכן, SEM יכול להגיע להגדלות של עד מיליון X עם רזולוציה לרוחב תת-ננומטר. בנוסף, SEM אינו מוגבל לתכונות הדמיה רק במישור המוקד, כמו במיקרוסקופיה קלה. לכן, אובייקטים מחוץ למישור המוקד נפתרים, בניגוד מיקרוסקופיה אור שבו הם נראים מטושטשים. פעולה זו מספקת עומק שדה מוגבר של עד פי 300 עם SEM.
כימאים משתמשים באופן נרחב ב- SEM כדי לנתח הרכב, מבנה וצורה של ישויות ננומטריות, כגון חלקיקי זרז.
וידאו זה יתווה את עקרונות מכשיר ה- SEM, וידגים את היסודות של הכנה ותפעול מדגם SEM במעבדה.
ב- SEM, דגימות חייבות להיות מוליכות להדמיה קונבנציונלית. דגימות שאינן מוליכות מצופות בשכבה דקה של מתכת, כגון זהב. לאחר מכן נוצרות תמונות על ידי סריקת קרן ממוקדת של אלקטרונים בעלי אנרגיה גבוהה על פני הדגימה.
קרן האלקטרונים המשמשת ב- SEM נוצרת על ידי אקדח אלקטרונים, המצויד בקתודה חוט טונגסטן. האלקטרונים נדחפים לכיוון האנודה, בכיוון המדגם, על ידי שדה חשמלי.
קרן האלקטרונים מתמקדת לאחר מכן בעדשות מעבים, ונכנסת לעדשה האובייקטיבית. העדשה האובייקטיבית חייבת להיות מכוילת על ידי המשתמש כדי למקד את קרן האלקטרונים במיקום קבוע על המדגם. לאחר מכן, הקרן הממוקדת נסרקת על פני הדגימה.
כאשר האלקטרונים העיקריים מתקשרים עם המדגם, הם מנהרים לעומק התלוי באנרגיית קרן האלקטרונים. אינטראקציה זו עם פני השטח גורמת לפליטת אלקטרונים משניים ומוחזרים, אשר נמדדים לאחר מכן על ידי הגלאים המתאימים שלהם.
עוצמת האות של האלקטרונים המשניים הנפלטים משתנה בהתאם לזווית המדגם. משטחים בניצב לקרן משחררים פחות אלקטרונים משניים, ולכן נראים כהים יותר. בקצה המשטחים, יותר אלקטרונים משתחררים והאזור נראה בהיר יותר. תופעה זו מייצרת תמונות עם מראה תלת-ממדי מוגדר היטב, כפי שמוצג בסריקת SEM זו של אזבסט.
לעומת זאת, אלקטרונים backscattered משתקף בכיוון ההפוך של קרן האלקטרונים. עוצמת הזיהוי עולה עם הגדלת מספר האטומי של המדגם, ומאפשרת רכישת מידע קומפוזיציה של משטח, כפי שמוצג בתמונת backscatter זו של תכלילים בזכוכית.
כעת, לאחר שעקרונות מכשיר ה- SEM תוארו, הפעולה הבסיסית של SEM תודגם במעבדה.
כדי להתחיל, sputter מצפה את המדגם על ידי הצבתו על ספח מדגם. ודא כי המדגם הוא יבש לחלוטין מנוגד לגז. במידת הצורך, סרט פחמן מוליך דו-צדדי עשוי לשמש כדי לדבוק במדגם לספח. מניחים את הדגימה לתוך מערכת מקרטעת. תקרט כמה ננומטרים של זהב על המדגם. עובי שכבת הזהב ישתנה בהתאם אם הציפוי מפריע למורפולוגיה של המדגם.
הסר את המדגם ממערכת המקרטעת. ודא שיש גשר מוליך מפני השטח מדגם אל ספח המתכת.
לאחר הדגימה כבר מצופה, הוא מוכן להיות בתמונה. כדי לעשות זאת, תחילה לפרוק את תא מדגם SEM ולאפשר לתא להגיע ללחץ נומינלי.
פתח את תא הדגימה של SEM והסר את שלב הדגימה. מניחים את הספח על שלב הדגימה, ומהדקים את הספח במקום.
אם המרחק בין העדשה לדגימה, הנקרא מרחק העבודה, אינו יכול להיות נשלט על ידי התוכנה, ודא כי הבמה ואת הספח יש את הגובה הנכון כדי לקבל תמונה.
שים את שלב הדגימה בתא הדגימה, וסגור את התא.
הפעל את משאבות הוואקום ואפשר למערכת לשאוב למטה.
כדי להתחיל בהדמיה, פתח את תוכנת SEM. בחר את מתח ההפעלה הרצוי הנע בין 1-30 kV. עם חומרים בצפיפות גבוהה, יש להשתמש במתחי האצה גבוהים יותר. בחר מתח האצה נמוך עבור חומרים בצפיפות נמוכה.
רוב תוכנות ה- SEM כוללות תכונת מיקוד אוטומטי. פעולה זו תרכוש מוקד של המדגם לשימוש כנקודת התחלה.
הגדר את ההגדלה לרמת גודל התצוגה המינימלית של פי 50.
ל- SEM מצבי סריקה שונים כגון סריקה מהירה וסריקה איטית. מצב סריקה מהיר יותר מספק קצב רענון מהיר יותר של המסך באיכות נמוכה יותר. בחר את מצב הסריקה המהירה כדי להתחיל, כדי למצוא את המדגם ולהתחיל מיקוד גס.
כוונן את מוקד הקורס עד שהתמונה תחדד. לאחר מכן, התאם את מיקום הבמה כך שניתן יהיה לראות את אזור העניין בתצוגה.
תחילה, התמקד בהגדלה הנמוכה ביותר באמצעות המוקד ה גס. לאחר מכן, הגדל את רמת ההגדלה עד לתכונה הרצויה. התאם את מוקד הקורס כדי למקד בערך את התמונה בהגדלה זו. במידת הצורך, התאימו את המוקד גס כאשר ההגדלה גדלה.
לאחר מכן, התאם את המוקד העדין כדי לשפר עוד יותר את התמונה. חזור על שלבי מיקוד אלה בכל פעם שההגדלה מוגברת.
עיוותי קרן אסימטריים עלולים לגרום לטשטוש התמונה, הנקראת אסטיגמציה, גם כאשר המדגם ממוקד היטב. כדי להקטין אפקט זה, הגדל את ההגדלה לרמה המרבית ומקד את התמונה באמצעות המוקד העדין. לאחר מכן התאם את הסטיגמה הן בכיוון x והן בכיוון y כדי לעצב מחדש את הקרן.
המשך להתאים את הגדרות המיקוד והסטיגמה עד שהתמונה תתמקד ככל האפשר ברמת ההגדלה המוגברת.
לאחר מכן חזור לרמת ההגדלה הרצויה.
ניתן לרכוש את תמונת ה- SEM במצב "תמונה איטית" או "תמונה מהירה". מצב "תמונה מהירה" יוצר תמונה באיכות נמוכה יותר, אך נרכש מהר יותר. מצב "תמונה איטית" יוצר תמונה באיכות גבוהה יותר, אך עשוי להרוות את פני השטח באלקטרונים.
כדי למדוד תכונות בתוך התמונה שנלכדה, השתמש בכלי המדידה של התוכנה.
רוב המכשירים כוללים אפשרויות מדידה כגון אורך, שטח וזווית.
כדי לקבוע אורך, בחרו את המרחק שיש למדוד בתמונת SEM. לחץ על התמונה כדי ליצור את נקודות ההתייחסות שינותחו על ידי התוכנה.
בסיום, כבה את ה- SEM בהתאם להנחיות היצרנים.
סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים משמשת לצילום מגוון רחב של דגימות.
ניתן להשתמש ב- SEM כדי ליצור חומרים מורכבים ומובנים מאוד, כגון קרום סיבי פחמן.
המדגם הראה רמה גבוהה של נקבוביות ומבנה תלת ממדי; נכס רצוי מאוד עבור יישומים כגון קטליזה.
SEM יכול לשמש גם כדי לדמיין דגימות ביולוגיות, כגון חיידקים. בדוגמה זו, השיער כמו נספחים, או פילי, של חיידקי המעיים צולמו עם SEM.
הליקובקטר פילורי גדל על לוחות אגר דם, והחיידקים נזרעו על פתקי כיסוי זכוכית.
דגימות מיובשות לחלוטין הורכבו, ומצופה ב-5 ננומטר של פלדיום-זהב כדי להפוך את המדגם להולכת.
לבסוף, המדגם היה בתמונה באמצעות SEM. H. pylori היו גלויים בקלות, עם פילי ננומטרי מדיד.
דוגמה זו מתארת כיצד ניתן להטמיע רקמת מוח בשרף יציב, ולאחר מכן להטביע אותה בשלושה ממדים באמצעות קרן יונים ממוקדת ו- SEM.
ראשית, רקמת המוח תוקנה והוטמעה בשרף. ואז אזור העניין זוהה וחתוך עם מיקרוטום.
לאחר מכן הוכנסה הדגימה לקרן היונים הממוקדת בסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים להדמיה תלת-ממדית. קרן היון הממוקדת שימשה אז להסרת שכבות דקות ברצף של המדגם. כל שכבה אותתה לפני ההסרה באמצעות SEM של backscatter.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים. כעת עליך להבין את עקרונות ההפעלה הבסיסיים של SEM וכיצד להכין ולנתח מדגם SEM.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
ה-SEM, הנראה באיור 2a, שימש לביצוע מדידות ולהשגת תמונות לדוגמה. המדגם כלל מלח נתרן כלורי (NaCl). הוא הונח על הספח כפי שניתן לראות באיור 2b, ואז כמה ננומטרים של זהב התנדנדו עליו כדי להפוך אותו מוליך. המדגם המוליך הוכנס לאזור מדגם SEM כפי שניתן לראות באיור 2c.
תמונות SEM הושגו ברמות הגדלה של פי 50, 200X, 500X, 1,000X ו-5,000X, כפי שניתן לראות באיור 3. איור 3a מציג מבט של ציפור עין על דגימת המלח בהגדלה של פי 50. איור 3b מתקרב לחלקיק מלח בודד בהגדלה של פי 200X. איור 3c מציג את אותה רמת הגדלה אך כולל מדידות שטח וקוטר שבוצעו בתוכנת SEM. איור תלת-ממדי מתקרב ל- 500X ומראה את שטח העניין בחלקיק המלח. איור 3e מראה הגדלה של פי 1,000, המאפשרת להתבונן בפינת חלקיק המלח שנפגע. איור 3f מציג הגדלה של פי 5,000, המאפשרת למשתמש להציג את מבנה חלקיק המלח.
איור 2. (א) תמונה של SEM. (ב) מלח NaCl שהונח על ספח מדגם עם סרט פחמן. (ג) ספח מדגם שהוכנס לשלב מדגם SEM לאחר שטופל בציפוי זהב.
איור 3. תמונות SEM של דגימה ברמות הגדלה שונות: (א) 50X, (ב) 200X, (ג) 200X עם מדידות, (ד) 500X, (ה) 1,000X ו- (ו) 5,000X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
ה- SEM הוא כלי רב עוצמה הנפוץ ברוב מוסדות המחקר בשל יכולתו לדמיין כל אובייקט מוליך, או טופל בציפוי מוליך. ה- SEM שימש לתמונה של עצמים כגון התקני מוליכים למחצה,2 ממברנות ביולוגיות,3 וחרקים,4 בין היתר. השתמשנו גם ב- SEM כדי לנתח ננו-סיביות וחומרים מבוססי נייר, ביו-חומרים, מבנים זעירים. כמובן, ישנם חומרים, כגון נוזלים, שלא ניתן להציב לתוך SEM סטנדרטי להדמיה, אבל פיתוח מתמשך של מיקרוסקופים אלקטרונים סריקה סביבתית (ESEM) מאפשר פונקציונליות כזו. ESEM דומה ל- SEM בכך שהוא משתמש באקדח אלקטרונים ומנתח את אינטראקציית האלקטרונים עם המדגם. ההבדל העיקרי הוא כי ESEM מחולק לשני תאים נפרדים. התא העליון מורכב מאקדח האלקטרונים ונכנס למצב ואקום גבוה, בעוד התא התחתון מכיל את המדגם ונכנס למצב לחץ גבוה. מכיוון שאזור המדגם אינו צריך להיכנס לוואקום, ניתן להשתמש בדגימות רטובות או ביולוגיות במהלך תהליך ההדמיה. יתרון נוסף של ESEM הוא כי המדגם לא צריך להיות מצופה עם חומר מוליך. עם זאת, ל- ESEM יש כמה חסרונות של ניגודיות תמונה נמוכה ומרחק עבודה קטן עקב סביבה גזית בתא המדגם. . כלל האצבע הכללי הוא שאם אתה מסוגל לצפות מדגם בשכבה מוליכת, אז זה יכול להיות בתמונה SEM, המאפשר כמעט את כל האובייקטים המוצקים להיות מנותח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
References
- Goldstein, J., Newbury, D., Joy, D., Lyman, C., Echlin, P., Lifshin, E., Sawyer, L., Michael, J. Scanning Electron Microscopy and X-ray Microanalysis. 3rd Ed. Springer, New York, NY. (2003).
- Purandare, S., Gomez, E.F., Steckl, A.J. High brightness phosphorescent organic light emitting diodes on transparent and flexible cellulose films. Nanotechnology. 25, 094012 (2014).
- Masuda, Y., Yamanaka, N., Ishikawa, A., Kataoka, M., Aral, T., Wakamatsu, K., Kuwahara, N., Nagahama, K., Ichikawa, K., Shimizu, A. Glomerular basement membrane injuries in IgA nephropathy evaluated by double immunostaining for a5(IV) and a2(IV) chains of type IV collagen and low-vacuum scanning electron microscopy. Clinical and Experimental Nephrology. 1-9. (2014).
- Kang, J.H., Lee, Y.J., Oh, B.K., Lee, S.K. Hyun, B.R. Lee, B.W, Choi, Y.G., Nam, K.S., Lim, J.D. Microstructure of the water spider (Argyroneta aquatic) using the scanning electron microscope Journal of Asia-Pacific Biodiversity. 7 484-488 (2014).
