Overview
Fonte: Laboratório do Dr. Andrew J. Steckl — Universidade de Cincinnati
Um microscópio eletrônico de varredura, ou SEM, é um poderoso microscópio que usa elétrons para formar uma imagem. Permite imagens de amostras condutoras em ampliações que não podem ser alcançadas usando microscópios tradicionais. Microscópios de luz modernos podem alcançar uma ampliação de ~1.000X, enquanto o MEI típico pode atingir ampliações de mais de 30.000X. Como o SEM não usa luz para criar imagens, as imagens resultantes que ele forma estão em preto e branco.
As amostras condutoras são carregadas no estágio amostral do SEM. Uma vez que a câmara de amostra atinja o vácuo, o usuário passará a alinhar a arma eletrônica no sistema ao local adequado. A arma eletrônica dispara um feixe de elétrons de alta energia, que viajam através de uma combinação de lentes e aberturas e eventualmente atingem a amostra. À medida que a arma eletrônica continua a disparar elétrons em uma posição precisa na amostra, elétrons secundários saltarão da amostra. Estes elétrons secundários são identificados pelo detector. O sinal encontrado a partir dos elétrons secundários é amplificado e enviado para o monitor, criando uma imagem 3D. Este vídeo demonstrará as capacidades de preparação, operação e imagem da sem.
Principles
Elétrons são gerados pelo aquecimento pela arma eletrônica, que age como um cátodo. Estes elétrons são impulsionados para o ânodo, na mesma direção da amostra, devido a um forte campo elétrico. Depois que o feixe de elétrons é condensado, ele entra na lente objetiva, que é calibrada pelo usuário para uma posição fixa na amostra. (Figura 1)
Uma vez que os elétrons atingem a amostra condutora, duas coisas podem acontecer. Primeiro, os elétrons primários que atingiram a amostra serão escavados através dela até uma profundidade que depende do nível de energia desses elétrons. Em seguida, os elétrons secundários e recattered atingirão a amostra e refletirão para fora dela. Esses elétrons refletidos são então medidos pelo detector de elétrons secundários (SE) ou backscattered (BS). Após o processamento do sinal, uma imagem da amostra é formada na tela. 1
No modo SE, elétrons secundários são atraídos por viés positivo na frente do detector por causa de sua baixa energia. A intensidade do sinal é variada dependendo do ângulo da amostra. Portanto, o modo SE fornece imagens altamente topográficas. Por outro lado, no modo BS, a direção dos elétrons é quase diretamente oposta à direção do feixe eletrônico e a intensidade de detecção é proporcional ao número atômico da amostra. Portanto, é menos topográfico, mas útil para imagens composicionais. O modo BS também é menos afetado pelo efeito de carregamento na amostra, o que é benéfico para amostras não condutoras. 1
Figura 1. Esquema do SEM.
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Procedure
1. Preparação da Amostra
- Coloque a amostra no stub da amostra. Se necessário, a fita de carbono pode ser usada para ligar a amostra adesivamente ao stub.
- Coloque a amostra em um sistema de sputtering de ouro. Usando uma sputter mini-ouro, sputter ouro para 30 s a ~ 70 mTorr pressão. Uma espessura de camada de ouro diferente pode ser necessária dependendo da geometria da amostra. Uma superfície mais áspera ou porosa requer um tempo mais longo de sputtering.
- Remova o stub do sistema de sputtering dourado.
2. Inserção de amostras e Startup SEM
- Desabasse a câmara SEM, permitindo que a câmara atinja pressão nominal.
- Abra o compartimento de amostras SEM e tire o estágio amostral.
- Insira o stub de amostra contendo a amostra no estágio. Aperte o stub no lugar.
- Se a distância z não puder ser controlada por software, certifique-se de que o estágio da amostra com amostra tenha altura adequada para obter a melhor imagem.
- Coloque o estágio amostral na câmara de amostras. Feche o compartimento de amostras.
- Ligue as bombas e deixe o sistema atingir o vácuo. O sistema notificará o usuário quando isso estiver concluído.
- Abra o software SEM. Selecione tensão de operação desejada variando de 1 a 30 kV. Maior tensão de operação dá melhor contraste de imagem, mas pode produzir menor resolução se as cargas se acumularem na amostra.
3. Capturando a Imagem SEM
- Inicie 'Auto Focus' no software SEM clicando no ícone chave. Isso adquirirá uma imagem focada da amostra para usar como ponto de partida.
- Certifique-se de que a ampliação está definida para o nível mínimo de zoom de 50X.
- Selecione o modo 'digitalização rápida'.
- Ajuste o foco no modo grosseiro até que um foco áspero seja adquirido.
- Ajuste o estágio manualmente usando os botões externos para que a região de interesse seja visível no visor.
- Aumente o nível de ampliação até que o recurso desejado seja observado. Ajuste o botão de foco grosseiro para focar aproximadamente a imagem nesta ampliação. Em seguida, melhore o foco usando o botão de foco fino para obter uma imagem focada no nível de ampliação desejado. Esta etapa será repetida sempre que o nível de ampliação for aumentado.
- Uma vez alcançada a ampliação desejada, ajuste o botão de foco fino para melhorar a clareza.
- Para otimizar a clareza da imagem, aumente a ampliação perto do nível máximo e, em seguida, concentre a imagem usando o botão de foco fino. Se uma imagem clara não puder ser obtida, ajuste a estigma na direção x e y. Continue ajustando o foco e as estigmas até que a imagem mais clara seja obtida no nível exagerado de ampliação.
- Depois de atingir uma imagem de qualidade da amostra, volte ao nível de ampliação desejado. A imagem pode ser tirada pressionando o botão de foto no modo 'foto lenta' ou 'foto rápida'. O modo 'foto lenta' dá melhor qualidade e alta resolução da imagem.
4. Fazer medições usando o software SEM
- Na lista suspensa 'Painéis', selecione 'M. Ferramentas'.
- Várias medidas como comprimento, área e ângulo podem ser medidas diretamente no software SEM. Para realizar uma dessas medidas, clique no ícone desejado na janela M. Ferramentas.
- Role até o local de medição na imagem SEM. As medições são feitas clicando na imagem para criar pontos de referência que serão analisados pelo software. Os pontos de dados medidos podem ser inseridos diretamente na imagem, se desejado pelo usuário.
- As imagens são então salvas no computador.
A microscopia eletrônica de varredura, ou SEM, é uma técnica poderosa usada em química e análise de materiais que usa um feixe de elétrons digitalizado para analisar a estrutura da superfície e a composição química de uma amostra.
Microscópios de luz modernos são limitados pela interação de ondas de luz visíveis com um objeto, chamado difração. A menor distância solucionável entre dois objetos, ou a resolução lateral, varia dependendo do tamanho do padrão de difração em comparação com o tamanho do objeto. Como resultado, os microscópios leves têm uma ampliação máxima de até 1.000X e uma resolução lateral de até 200 nm em situações ideais.
O SEM não é limitado pela difração, pois usa um feixe de elétrons em vez de luz. Portanto, um SEM pode atingir ampliações de até um milhão de X com resolução lateral subnómetro. Além disso, o SEM não se limita aos recursos de imagem apenas no plano focal, como acontece com a microscopia leve. Assim, objetos fora do plano focal são resolvidos, em oposição à microscopia de luz onde eles parecem embaçados. Isso fornece até 300 vezes mais profundidade de campo com SEM.
Os químicos usam amplamente o SEM para analisar a composição, estrutura e forma da superfície de entidades nanoescala, como partículas catalisadoras.
Este vídeo delineará os princípios do instrumento SEM e demonstrará os fundamentos da preparação e operação da amostra SEM em laboratório.
No SEM, as amostras devem ser condutoras para imagens convencionais. Amostras não condutoras são revestidas com uma fina camada de metal, como o ouro. As imagens são então geradas através da varredura de um feixe focalizado de elétrons de alta energia através da amostra.
O feixe de elétrons usado no SEM é gerado por uma arma eletrônica, equipada com um cátodo de filamento de tungstênio. Os elétrons são impulsionados em direção ao ânodo, na direção da amostra, por um campo elétrico.
O feixe de elétrons é então focado em lentes condensadoras, e entra na lente objetiva. A lente objetiva deve ser calibrada pelo usuário para concentrar o feixe de elétrons em uma posição fixa na amostra. O feixe focalizado é então rasterizado através da amostra.
Quando os elétrons primários interagem com a amostra, eles encapsulam a uma profundidade que depende da energia do feixe de elétrons. Essa interação com a superfície resulta na emissão de elétrons secundários e recattered, que são então medidos por seus respectivos detectores.
A intensidade do sinal dos elétrons secundários emitidos varia dependendo do ângulo da amostra. Superfícies perpendiculares ao feixe liberam menos elétrons secundários e, portanto, parecem mais escuras. Na borda das superfícies, mais elétrons são liberados e a área parece mais brilhante. Este fenômeno produz imagens com aparência 3D bem definida, como mostra esta varredura SEM de amianto.
Em contraste, elétrons rescattered são refletidos na direção oposta do feixe de elétrons. A intensidade de detecção aumenta com o aumento do número atômico da amostra, permitindo a aquisição de informações composicionais de uma superfície, como mostrado nesta imagem de backscatter de inclusões no vidro.
Agora que os princípios do instrumento SEM foram delineados, o funcionamento básico de um SEM será demonstrado em laboratório.
Para começar, cubra a amostra colocando-a em um stub de amostra. Certifique-se de que a amostra está completamente seca e desgaseada. Se necessário, a fita de carbono condutora de dois lados pode ser usada para aderir a amostra ao stub. Coloque a amostra em um sistema de sputtering. Sputter alguns nanômetros de ouro na amostra. A espessura da camada de ouro variará dependendo se o revestimento interferir com a morfologia da amostra.
Remova a amostra do sistema de sputtering. Certifique-se de que há uma ponte condutora desde a superfície da amostra até a amostra metálica.
Uma vez revestida a amostra, ela está pronta para ser image. Para isso, primeiro desabase a câmara de amostra SEM e permita que a câmara atinja pressão nominal.
Abra o compartimento de amostra SEM e remova o estágio da amostra. Coloque o stub sobre o estágio da amostra e aperte o stub no lugar.
Se a distância entre a lente e a amostra, chamada de distância de trabalho, não puder ser controlada pelo software, certifique-se de que o estágio e o stub tenham a altura adequada para obter uma imagem.
Coloque o estágio da amostra na câmara de amostra e feche o compartimento.
Ligue as bombas de vácuo e deixe o sistema bombear para baixo.
Para começar a imagem, abra o software SEM. Selecione a tensão de operação desejada variando de 1 a 30 kV. Com materiais de alta densidade, devem ser utilizadas tensões de aceleração mais altas. Selecione baixa tensão acelerada para materiais de baixa densidade.
A maioria dos softwares SEM inclui um recurso de foco automático. Isso adquirirá um foco da amostra para usar como ponto de partida.
Defina a ampliação para o nível mínimo de zoom de 50X.
O SEM tem diferentes modos de varredura, como varredura rápida e varredura lenta. O modo de varredura mais rápido oferece uma taxa de atualização mais rápida da tela com menor qualidade. Selecione o modo de varredura rápida para começar, a fim de encontrar a amostra e iniciar o foco grosseiro.
Ajuste o foco do curso até que a imagem fique mais nítida. Em seguida, ajuste o posicionamento do palco para que a região de interesse possa ser vista no visor.
Primeiro, concentre-se na menor ampliação usando o foco grosseiro. Em seguida, aumente o nível de ampliação até que o recurso desejado seja observado. Ajuste o foco do curso para focar aproximadamente a imagem nesta ampliação. Se necessário, ajuste um foco grosseiro quando a ampliação aumentar.
Em seguida, ajuste o foco fino para melhorar ainda mais a imagem. Repita essas etapas de foco cada vez que a ampliação for aumentada.
Distorções assimétricas do feixe podem causar desfoque da imagem, chamada tigmatismo, mesmo quando a amostra está bem focada. Para diminuir esse efeito, aumente a ampliação para o nível máximo e concentre a imagem usando o foco fino. Em seguida, ajuste a estigma na direção x e y para remodelar o feixe.
Continue ajustando as configurações de foco e estigma até que a imagem esteja o mais focada possível no aumento do nível de ampliação.
Em seguida, retorne ao nível de ampliação desejado.
A imagem SEM pode ser adquirida no modo "foto lenta" ou "foto rápida". O modo "foto rápida" cria uma imagem de menor qualidade, mas é adquirido mais rapidamente. O modo "foto lenta" cria uma imagem de maior qualidade, mas pode saturar a superfície com elétrons.
Para medir recursos dentro da imagem capturada, utilize as ferramentas de medição do software.
A maioria dos instrumentos inclui opções de medição, como comprimento, área e ângulo.
Para determinar o comprimento, selecione a distância a ser medida na imagem SEM. Clique na imagem para criar os pontos de referência que serão analisados pelo software.
Quando terminar, desligue o MEI de acordo com as diretrizes dos fabricantes.
A microscopia eletrônica de varredura é usada para imagens de uma ampla gama de amostras.
O SEM pode ser usado para imagens complexas e materiais altamente estruturados, como uma membrana de fibra de carbono.
A amostra apresentou alto grau de porosidade e estrutura tridimensional; uma propriedade que é altamente desejável para aplicações como a catálise.
O SEM também pode ser usado para imagens de amostras biológicas, como bactérias. Neste exemplo, os cabelos como apêndices, ou pili, de bactérias intestinais foram imageados com SEM.
Helicobacter pylori foram cultivados em placas de ágar de sangue, e as bactérias semeadas em deslizamentos de tampa de vidro.
Foram montadas amostras totalmente secas e revestidas com 5 nm de paládio-ouro para tornar a amostra condutora.
Finalmente, a amostra foi imageda utilizando SEM. H. pylori eram facilmente visíveis, com pili nanoescala mensurável.
Este exemplo descreve como o tecido cerebral pode ser incorporado em uma resina estável, e então imagedo em três dimensões usando um feixe de íons focalado e SEM.
Primeiro, o tecido cerebral foi fixado e embutido na resina. Em seguida, a região de interesse identificou e cortou com um microtome.
A amostra foi então inserida no microscópio eletrônico de varredura do feixe de íons focalizado para imagens tridimensionais. O feixe de íons focalado foi então usado para remover sequencialmente camadas finas da amostra. Cada camada foi imageda antes da remoção usando backscatter SEM.
Você acabou de assistir a introdução do JoVE à microscopia eletrônica. Agora você deve entender os princípios básicos de operação do SEM e como preparar e analisar uma amostra SEM.
Obrigado por assistir!
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Results
O SEM, visto na Figura 2a,tem sido utilizado para fazer medições e adquirir fotos de amostras. A amostra consistia em sal de cloreto de sódio (NaCl). Foi colocado no stub como visto na Figura 2b, em seguida, alguns nanômetros de ouro foi sputtered sobre ele para torná-lo condutivo. A amostra condutora foi então colocada na área amostral SEM, conforme visto na Figura 2c.
As imagens SEM foram obtidas nos níveis de ampliação 50X, 200X, 500X, 1.000X e 5.000X, como visto na Figura 3. A Figura 3a mostra uma visão olho-de-pássaro da amostra de sal na ampliação de 50X. A Figura 3b então se aproxima de uma partícula de sal individual em uma ampliação de 200X. A Figura 3c mostra este mesmo nível de ampliação, mas inclui medições de área e diâmetro feitas dentro do software SEM. A figura 3d então amplia para 500X, mostrando a área de interesse na partícula de sal. A Figura 3e mostra uma ampliação de 1.000X, permitindo observar o canto da partícula de sal que foi danificada. A Figura 3f mostra uma ampliação de 5.000X, permitindo que o usuário visualize a estrutura da partícula salgada.
Figura 2. a Imagem de SEM. (b) Sal naCl colocado na amostra com fita de carbono. c Amostragem colocada em fase amostral SEM após ser tratada com revestimento dourado.
Figura 3. Imagens SEM da amostra em vários níveis de ampliação: (a) 50X, (b) 200X, (c) 200X com medições, (d) 500X, (e) 1.000X e (f) 5.000X.
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Applications and Summary
O SEM é uma ferramenta muito poderosa que é comum na maioria das instituições de pesquisa por causa de sua capacidade de imagem de qualquer objeto que seja condutor, ou tenha sido tratado com um revestimento condutor. O SEM tem sido utilizado para imagens de objetos como dispositivos semicondutores,2 membranas biológicas,3 e insetos,4 entre outros. Também utilizamos o SEM para analisar nanofibras e materiais à base de papel, biomateriais, estruturas micropatteradas. Claro, existem materiais, como líquidos, que não podem ser colocados em um SEM padrão para imagem, mas o desenvolvimento contínuo de microscópios eletrônicos de varredura ambiental (ESEM) permite tal funcionalidade. ESEM é semelhante ao SEM na qual usa uma arma eletrônica e analisa a interação eletrônica com a amostra. A principal diferença é que o ESEM é dividido em duas câmaras separadas. A câmara superior consiste na arma eletrônica e entra em um estado de alto vácuo, enquanto a câmara inferior contém a amostra e entra em um estado de alta pressão. Como a área da amostra não precisa entrar em um vácuo, amostras molhadas ou biológicas podem ser usadas durante o processo de imagem. Outro benefício do ESEM é que a amostra não precisa ser revestida com material condutor. No entanto, o ESEM tem algumas desvantagens de baixo contraste de imagem e pequena distância de trabalho devido ao ambiente gasoso na câmara amostral. . A regra geral é que se você for capaz de revestir uma amostra com uma camada condutora, ela pode ser imageda em um SEM, permitindo que quase todos os objetos sólidos sejam analisados.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
References
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- Purandare, S., Gomez, E.F., Steckl, A.J. High brightness phosphorescent organic light emitting diodes on transparent and flexible cellulose films. Nanotechnology. 25, 094012 (2014).
- Masuda, Y., Yamanaka, N., Ishikawa, A., Kataoka, M., Aral, T., Wakamatsu, K., Kuwahara, N., Nagahama, K., Ichikawa, K., Shimizu, A. Glomerular basement membrane injuries in IgA nephropathy evaluated by double immunostaining for a5(IV) and a2(IV) chains of type IV collagen and low-vacuum scanning electron microscopy. Clinical and Experimental Nephrology. 1-9. (2014).
- Kang, J.H., Lee, Y.J., Oh, B.K., Lee, S.K. Hyun, B.R. Lee, B.W, Choi, Y.G., Nam, K.S., Lim, J.D. Microstructure of the water spider (Argyroneta aquatic) using the scanning electron microscope Journal of Asia-Pacific Biodiversity. 7 484-488 (2014).
