Overview
Fonte: Laboratorio del Dr. Andrew J. Steckl — Università di Cincinnati
Un microscopio elettronico a scansione, o SEM, è un potente microscopio che utilizza gli elettroni per formare un'immagine. Consente l'imaging di campioni conduttivi a ingrandimenti che non possono essere raggiunti utilizzando microscopi tradizionali. I moderni microscopi otrici possono raggiungere un ingrandimento di ~ 1.000X, mentre il tipico SEM può raggiungere ingrandimenti di oltre 30.000X. Poiché il SEM non utilizza la luce per creare immagini, le immagini risultanti che forma sono in bianco e nero.
I campioni conduttivi vengono caricati sullo stadio campione del SEM. Una volta che la camera del campione raggiunge il vuoto, l'utente procederà ad allineare la pistola elettronica nel sistema alla posizione corretta. La pistola elettronica spara un fascio di elettroni ad alta energia, che viaggiano attraverso una combinazione di lenti e aperture e alla fine colpiscono il campione. Mentre la pistola elettronica continua a sparare elettroni in una posizione precisa sul campione, gli elettroni secondari rimbalzeranno dal campione. Questi elettroni secondari sono identificati dal rivelatore. Il segnale trovato dagli elettroni secondari viene amplificato e inviato al monitor, creando un'immagine 3D. Questo video dimostrerà la preparazione, il funzionamento e le capacità di imaging dei campioni SEM.
Principles
Gli elettroni sono generati dal riscaldamento dalla pistola elettronica, che agisce come un catodo. Questi elettroni sono spinti verso l'anodo, nella stessa direzione del campione, a causa di un forte campo elettrico. Dopo che il fascio di elettroni è condensato, entra nella lente dell'obiettivo, che viene calibrata dall'utente in una posizione fissa sul campione. (Figura 1)
Una volta che gli elettroni colpiscono il campione conduttivo, possono accadere due cose. In primo luogo, gli elettroni primari che colpiscono il campione attraverseranno il campione fino a una profondità che dipende dal livello di energia di quegli elettroni. Quindi, gli elettroni secondari e retrodifati colpiranno il campione e si rifletteranno verso l'esterno da esso. Questi elettroni riflessi vengono quindi misurati dal rivelatore di elettroni secondari (SE) o retrodifati (BS). Dopo l'elaborazione del segnale, sullo schermo si forma un'immagine del campione. 1
In modalità SE, gli elettroni secondari sono attratti da bias positivi sulla parte anteriore del rivelatore a causa della loro bassa energia. L'intensità del segnale varia a seconda dell'angolo del campione. Pertanto, la modalità SE fornisce immagini altamente topografiche. D'altra parte, in modalità BS, la direzione degli elettroni è quasi direttamente opposta alla direzione dell'e-beam e l'intensità di rilevamento è proporzionale al numero atomico del campione. Pertanto, è meno topografico, ma utile per le immagini compositime. La modalità BS è anche meno influenzata dall'effetto di carica sul campione, che è vantaggioso per i campioni non conduttivi. 1
Figura 1. Schema del SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. Preparazione del campione
- Posizionare il campione sullo stub del campione. Se necessario, il nastro di carbonio può essere utilizzato per incollare adesivamente il campione al mozzicone.
- Posizionare il campione in un sistema di sputtering dorato. Utilizzando un mini-gold sputter, sputter gold per 30 s a ~ 70 mTorr di pressione. Potrebbe essere necessario uno spessore dello strato d'oro diverso a seconda della geometria del campione. Una superficie più ruvida o porosa richiede un tempo di sputtering più lungo.
- Rimuovere lo stub dal sistema di sputtering dorato.
2. Inserimento del campione e avvio SEM
- Sfiatare la camera SEM, consentendo alla camera di raggiungere la pressione nominale.
- Aprire il compartimento del campione SEM ed eseguare lo stadio del campione.
- Inserire lo stub campione contenente il campione sullo stage. Stringere il mozzicone in posizione.
- Se la distanza z non può essere controllata dal software, assicurarsi che lo stadio campione con stub campione abbia l'altezza corretta per ottenere l'immagine migliore.
- Mettere lo stadio del campione nella camera del campione. Chiudere il compartimento del campione.
- Accendere le pompe e consentire al sistema di raggiungere il vuoto. Il sistema avviserà l'utente quando questo è completato.
- Aprire il software SEM. Selezionare la tensione di funzionamento desiderata da 1 a 30 kV. Una tensione di funzionamento più elevata offre un migliore contrasto dell'immagine, ma può produrre una risoluzione inferiore se le cariche si accumulano nel campione.
3. Acquisizione dell'immagine SEM
- Inizia "Messa a fuoco automatica" nel software SEM facendo clic sull'icona della chiave. Questo acquisirà un'immagine focalizzata del campione da utilizzare come punto di partenza.
- Assicurarsi che l'ingrandimento sia impostato sul livello minimo di zoom di 50X.
- Seleziona la modalità "scansione veloce".
- Regolare la messa a fuoco in modalità grossolana fino a quando non viene acquisita una messa a fuoco approssimativa.
- Regolare manualmente lo stage utilizzando le manopole esterne in modo che la regione di interesse sia visibile sul display.
- Aumentare il livello di ingrandimento fino a quando non viene osservata la caratteristica desiderata. Regolare la manopola di messa a fuoco grossolana per mettere a fuoco approssimativamente l'immagine a questo ingrandimento. Quindi, migliora la messa a fuoco utilizzando la manopola di messa a fuoco fine per ottenere un'immagine focalizzata al livello di ingrandimento desiderato. Questo passaggio verrà ripetuto ogni volta che il livello di ingrandimento viene aumentato.
- Una volta raggiunto l'ingrandimento desiderato, regolare la manopola di messa a fuoco fine per migliorare la chiarezza.
- Per ottimizzare la nitidezza dell'immagine, aumentare l'ingrandimento vicino al livello massimo e quindi mettere a fuoco l'immagine utilizzando la manopola di messa a fuoco fine. Se non è possibile ottenere un'immagine chiara, regolare la stigmatizzazione sia nella direzione x che in quella y. Continua a regolare la messa a fuoco e le stigmi fino a ottenere l'immagine più chiara a livello di ingrandimento esagerato.
- Dopo aver raggiunto un'immagine di qualità del campione, tornare al livello di ingrandimento desiderato. L'immagine può essere scattata premendo il pulsante della foto in modalità "foto lenta" o "foto veloce". La modalità "foto lenta" offre una migliore qualità e un'alta risoluzione dell'immagine.
4. Effettuare misurazioni utilizzando il software SEM
- Nell'elenco a discesa "Pannelli", seleziona "M. Strumenti".
- Varie misure come lunghezza, area e angolo possono essere misurate direttamente nel software SEM. Per eseguire una di queste misurazioni, fare clic sull'icona desiderata nella finestra M. Strumenti.
- Scorri fino al sito di misurazione sull'immagine SEM. Le misurazioni vengono effettuate cliccando sull'immagine per creare dei punti di riferimento che verranno analizzati dal software. I punti dati misurati possono essere inseriti direttamente sull'immagine se lo desiderano l'utente.
- Le immagini vengono quindi salvate sul computer.
La microscopia elettronica a scansione, o SEM, è una potente tecnica utilizzata in chimica e analisi dei materiali che utilizza un fascio di elettroni scansionato per analizzare la struttura superficiale e la composizione chimica di un campione.
I moderni microscopi ottica sono limitati dall'interazione delle onde luminose visibili con un oggetto, chiamato diffrazione. La più piccola distanza risolvibile tra due oggetti, o la risoluzione laterale, varia a seconda delle dimensioni del modello di diffrazione rispetto alle dimensioni dell'oggetto. Di conseguenza, i microscopi ottivi hanno un ingrandimento massimo fino a 1.000X e una risoluzione laterale fino a 200 nm in situazioni ideali.
Il SEM non è limitato dalla diffrazione, in quanto utilizza un fascio di elettroni piuttosto che la luce. Pertanto, un SEM può raggiungere ingrandimenti fino a un milione di X con risoluzione laterale sub-nanometrica. Inoltre, la SEM non si limita alle caratteristiche di imaging solo sul piano focale, come con la microscopia ottica. Pertanto, gli oggetti al di fuori del piano focale sono risolti, al contrario della microscopia ottica in cui appaiono sfocati. Ciò fornisce una profondità di campo fino a 300 volte superiore con SEM.
I chimici usano ampiamente il SEM per analizzare la composizione superficiale, la struttura e la forma di entità su scala nanometrica, come le particelle catalizzanti.
Questo video delineerà i principi dello strumento SEM e dimostrerà le basi della preparazione e del funzionamento dei campioni SEM in laboratorio.
Nel SEM, i campioni devono essere conduttivi per l'imaging convenzionale. I campioni non conduttivi sono rivestiti con un sottile strato di metallo, come l'oro. Le immagini vengono quindi generate scansionando un fascio focalizzato di elettroni ad alta energia attraverso il campione.
Il fascio di elettroni utilizzato in SEM è generato da una pistola elettronica, dotata di un catodo a filamento di tungsteno. Gli elettroni sono spinti verso l'anodo, nella direzione del campione, da un campo elettrico.
Il fascio di elettroni viene quindi focalizzato sulle lenti del condensatore ed entra nella lente dell'obiettivo. L'obiettivo deve essere calibrato dall'utente per focalizzare il fascio di elettroni su una posizione fissa sul campione. Il fascio focalizzato viene quindi scansionato raster attraverso il campione.
Quando gli elettroni primari interagiscono con il campione, scavano un tunnel verso una profondità che dipende dall'energia del fascio di elettroni. Questa interazione con la superficie provoca l'emissione di elettroni secondari e retrodatterati, che vengono poi misurati dai rispettivi rivelatori.
L'intensità del segnale degli elettroni secondari emessi varia a seconda dell'angolo del campione. Le superfici perpendicolari al fascio rilasciano meno elettroni secondari e quindi appaiono più scure. Ai margini delle superfici, vengono rilasciati più elettroni e l'area appare più luminosa. Questo fenomeno produce immagini con un aspetto 3D ben definito, come mostrato in questa scansione SEM dell'amianto.
Al contrario, gli elettroni retrodifati vengono riflessi nella direzione opposta del fascio di elettroni. L'intensità di rilevamento aumenta con l'aumentare del numero atomico del campione, consentendo l'acquisizione di informazioni compositime di una superficie, come mostrato in questa immagine di backscatter di inclusioni in vetro.
Ora che i principi dello strumento SEM sono stati delineati, il funzionamento di base di un SEM sarà dimostrato in laboratorio.
Per iniziare, sputter rivestire il campione posizionandolo su uno stub campione. Assicurarsi che il campione sia completamente asciutto e degassato. Se necessario, è possibile utilizzare un nastro di carbonio conduttivo a doppia faccia per far aderire il campione allo stub. Posizionare il campione in un sistema di sputtering. Sputter alcuni nanometri d'oro sul campione. Lo spessore dello strato d'oro varierà a seconda che il rivestimento interferisca con la morfologia del campione.
Rimuovere il campione dal sistema di sputtering. Assicurarsi che vi sia un ponte conduttivo dalla superficie del campione al mozzicone di metallo.
Una volta che il campione è stato rivestito, è pronto per essere ripreso. Per fare ciò, prima sfiatare la camera del campione SEM e consentire alla camera di raggiungere la pressione nominale.
Aprire il compartimento del campione SEM e rimuovere lo stadio del campione. Posizionare lo stub sullo stadio campione e stringere lo stub in posizione.
Se la distanza tra l'obiettivo e il campione, chiamata distanza di lavoro, non può essere controllata dal software, assicurarsi che lo stadio e lo stub abbiano l'altezza corretta per ottenere un'immagine.
Mettere lo stadio del campione nella camera del campione e chiudere il compartimento.
Accendere le pompe per vuoto e consentire al sistema di pompare verso il basso.
Per iniziare l'imaging, aprire il software SEM. Selezionare la tensione di funzionamento desiderata da 1 a 30 kV. Con materiali ad alta densità, dovrebbero essere utilizzate tensioni di accelerazione più elevate. Selezionare una bassa tensione di accelerazione per materiali a bassa densità.
La maggior parte dei software SEM include una funzione di messa a fuoco automatica. Questo acquisirà un focus del campione da utilizzare come punto di partenza.
Impostare l'ingrandimento sul livello di zoom minimo di 50X.
SEM ha diverse modalità di scansione come la scansione veloce e la scansione lenta. La modalità di scansione più veloce offre una frequenza di aggiornamento più rapida dello schermo con una qualità inferiore. Selezionare la modalità di scansione rapida per iniziare, al fine di trovare il campione e iniziare la messa a fuoco grossolana.
Regola la messa a fuoco del percorso fino a quando l'immagine diventa più nitida. Quindi, regola il posizionamento del palco in modo che la regione di interesse possa essere vista sul display.
Innanzitutto, metti a fuoco l'ingrandimento più basso usando la messa a fuoco grossolana. Quindi, aumentare il livello di ingrandimento fino a quando non viene osservata la funzione desiderata. Regola la messa a fuoco del corso per mettere a fuoco approssimativamente l'immagine a questo ingrandimento. Se necessario, regolare una messa a fuoco grossolana quando l'ingrandimento è aumentato.
Quindi, regola la messa a fuoco fine per migliorare ulteriormente l'immagine. Ripetere questi passaggi di messa a fuoco ogni volta che l'ingrandimento viene aumentato.
Le distorsioni asimmetriche del fascio possono causare sfocatura dell'immagine, chiamata astigmatismo, anche quando il campione è ben focalizzato. Per diminuire questo effetto, aumentate l'ingrandimento al livello massimo e mettete a fuoco l'immagine utilizzando la messa a fuoco fine. Quindi regolare la stigmatizzazione sia nella direzione x che in quella y per rimodellare il raggio.
Continua a regolare le impostazioni di messa a fuoco e stigmatizzazione fino a quando l'immagine non è il più focalizzata possibile al livello di ingrandimento aumentato.
Quindi tornare al livello di ingrandimento desiderato.
L'immagine SEM può essere acquisita in modalità "foto lenta" o "foto veloce". La modalità "foto veloce" crea un'immagine di qualità inferiore, ma viene acquisita più velocemente. La modalità "foto lenta" crea un'immagine di qualità superiore, ma può saturare la superficie con elettroni.
Per misurare le caratteristiche all'interno dell'immagine acquisita, utilizzare gli strumenti di misurazione del software.
La maggior parte degli strumenti include opzioni di misurazione come lunghezza, area e angolo.
Per determinare la lunghezza, selezionate la distanza da misurare sull'immagine SEM. Clicca sull'immagine per creare i punti di riferimento che verranno analizzati dal software.
Al termine, spegnere il SEM secondo le linee guida del produttore.
La microscopia elettronica a scansione viene utilizzata per l'immagine di una vasta gamma di campioni.
SEM può essere utilizzato per l'immagine di materiali complessi e altamente strutturati, come una membrana in fibra di carbonio.
Il campione ha mostrato un alto grado di porosità e struttura tridimensionale; una proprietà altamente desiderabile per applicazioni come la catalisi.
SeM può anche essere utilizzato per l'immagine di campioni biologici, come i batteri. In questo esempio, i capelli come appendici, o pili, dei batteri intestinali sono stati ripresi con SEM.
L'Helicobacter pylori è stato coltivato su lastre di agar di sangue e i batteri seminati su coperture di vetro scivolano.
Sono stati montati campioni completamente essiccati e rivestiti con 5 nm di palladio-oro per rendere il campione conduttivo.
Infine, il campione è stato ripreso utilizzando SEM. H. pylori erano facilmente visibili, con pili misurabili su scala nanometrica.
Questo esempio descrive come il tessuto cerebrale può essere incorporato in una resina stabile e quindi ripreso in tre dimensioni utilizzando un fascio ionico focalizzato e SEM.
In primo luogo, il tessuto cerebrale è stato fissato e incorporato nella resina. Quindi la regione di interesse identificata e affettata con un microtomo.
Il campione è stato quindi inserito nel microscopio elettronico a scansione a fascio iondo focalizzato per l'imaging tridimensionale. Il fascio ioio focalizzato è stato quindi utilizzato per rimuovere in sequenza strati sottili del campione. Ogni livello è stato ripreso prima della rimozione utilizzando il backscatter SEM.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla microscopia elettronica a scansione. Ora dovresti comprendere i principi operativi di base del SEM e come preparare e analizzare un campione SEM.
Grazie per l'attenzione!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
Il SEM, visto nella Figura 2a, è stato utilizzato per effettuare misurazioni e acquisire foto campione. Il campione era costituito da sale di cloruro di sodio (NaCl). È stato posizionato sullo stub come si vede nella Figura 2b, poi alcuni nanometri d'oro sono stati sputtered su di esso per renderlo conduttivo. Il campione conduttivo è stato quindi inserito nell'area del campione SEM come si vede nella Figura 2c.
Le immagini SEM sono state ottenute a livelli di ingrandimento 50X, 200X, 500X, 1.000X e 5.000X, come si vede nella Figura 3. La Figura 3a mostra una vista a volo d'uccello del campione di sale con ingrandimento 50X. La Figura 3b ingrandisce quindi una singola particella salina con un ingrandimento di 200X. La Figura 3c mostra lo stesso livello di ingrandimento, ma include misurazioni di area e diametro effettuate all'interno del software SEM. La figura 3d quindi esegue lo zoom a 500X, mostrando l'area di interesse sulla particella salina. La Figura 3e mostra un ingrandimento di 1.000X, che consente di osservare l'angolo della particella salina che è stata danneggiata. La Figura 3f mostra un ingrandimento di 5.000X, consentendo all'utente di visualizzare la struttura della particella salina.
Figura 2. (a) Immagine di SEM. (b) Sale NaCl posto sul campione di stub con nastro di carbonio. c) Campione di stub posto nella fase di campionamento SEM dopo essere stato trattato con rivestimento in oro.
Figura 3. Immagini SEM del campione a vari livelli di ingrandimento: (a) 50X, (b) 200X, (c) 200X con misurazioni, (d) 500X, (e) 1.000X e (f) 5.000X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
Il SEM è uno strumento molto potente che è comune nella maggior parte degli istituti di ricerca a causa della sua capacità di immaginare qualsiasi oggetto che è conduttivo o è stato trattato con un rivestimento conduttivo. Il SEM è stato utilizzato per l'immagine di oggetti come dispositivi a semiconduttore,2 membrane biologiche,3 e insetti,4 tra gli altri. Abbiamo anche utilizzato il SEM per analizzare nanofibre e materiali a base di carta, biomateriali, strutture micropatterned. Naturalmente, ci sono materiali, come i liquidi, che non possono essere inseriti in un SEM standard per l'imaging, ma lo sviluppo continuo di microscopi elettronici a scansione ambientale (ESEM) consente tale funzionalità. ESEM è simile a SEM in quanto utilizza una pistola elettronica e analizza l'interazione elettronica con il campione. La differenza principale è che l'ESEM è diviso in due camere separate. La camera superiore è costituita dalla pistola elettronica e va in uno stato di alto vuoto, mentre la camera inferiore contiene il campione ed entra in uno stato di alta pressione. Poiché l'area del campione non ha bisogno di entrare nel vuoto, è possibile utilizzare campioni umidi o biologici durante il processo di imaging. Un altro vantaggio dell'ESEM è che il campione non ha bisogno di essere rivestito con un materiale conduttivo. Tuttavia, ESEM presenta alcuni svantaggi di basso contrasto dell'immagine e piccola distanza di lavoro a causa dell'ambiente gassoso nella camera del campione. . La regola generale è che se si è in grado di rivestire un campione con uno strato conduttivo, allora può essere ripreso in un SEM, consentendo di analizzare quasi tutti gli oggetti solidi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
References
- Goldstein, J., Newbury, D., Joy, D., Lyman, C., Echlin, P., Lifshin, E., Sawyer, L., Michael, J. Scanning Electron Microscopy and X-ray Microanalysis. 3rd Ed. Springer, New York, NY. (2003).
- Purandare, S., Gomez, E.F., Steckl, A.J. High brightness phosphorescent organic light emitting diodes on transparent and flexible cellulose films. Nanotechnology. 25, 094012 (2014).
- Masuda, Y., Yamanaka, N., Ishikawa, A., Kataoka, M., Aral, T., Wakamatsu, K., Kuwahara, N., Nagahama, K., Ichikawa, K., Shimizu, A. Glomerular basement membrane injuries in IgA nephropathy evaluated by double immunostaining for a5(IV) and a2(IV) chains of type IV collagen and low-vacuum scanning electron microscopy. Clinical and Experimental Nephrology. 1-9. (2014).
- Kang, J.H., Lee, Y.J., Oh, B.K., Lee, S.K. Hyun, B.R. Lee, B.W, Choi, Y.G., Nam, K.S., Lim, J.D. Microstructure of the water spider (Argyroneta aquatic) using the scanning electron microscope Journal of Asia-Pacific Biodiversity. 7 484-488 (2014).
