Overview
בביוכימיה, שיטות טיהור מבוססות כרומטוגרפיה משמשות כדי לבודד תרכובות מתערובת מורכבת. שתי שיטות כאלה המשמשות בדרך כלל על ידי ביוכימאים הן כרומטוגרפיה גודל-הדרה וכרומטוגרפיה זיקה. בכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל, עמודה עמוסה חרוזים נקבוביים מפרידה בין רכיבים של תערובת בהתבסס על גודל. מצד שני, כרומטוגרפיה של זיקה מאפשרת הפרדה ספציפית יותר של ביומולקולים באמצעות עמודה המורכבת משלב נייח, המכיל ליגנדים ספציפיים למטרה.
וידאו זה משמש מבוא לכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל וזיקה, כמו גם למושגים השולטים בהם. הליך שלב אחר שלב לטיהור של חלבון מתויג היסטידין על ידי כרומטוגרפיה זיקה מתכתית משותקת מתואר. יישומים עבור שתי שיטות כרומטוגרפיות אלה בביוכימיה ומחקר ביו-רפואי הם גם פרופיל.
"כרומטוגרפיה" מתייחס למגוון רחב של שיטות המשמשות לבידוד רכיב מתערובת מורכבת, צעד חיוני לפני שניתן לקבוע את תכונותיו ופעילותו של הביו-מוקולקול. לכל טכניקה כרומטוגרפית יש מנגנון שונה להפרדה, בהתאם למטריקס לדוגמה ולתרכובת היעד. וידאו זה יתמקד בעקרונות ובתפעול של שתי שיטות המשותפות לביוכימיה: מידה-הדרה וכרומטוגרפיה של זיקה.
כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל או SEC מבוססת על גודל התרכובות במדגם. שלב נייד המכיל את המדגם נוסף לעמודה עם חומר נקבובי: השלב הנייח. המולקולות במדגם מתחלקות ל-1 מתוך 3 קטגוריות.
מולקולות גדולות מכדי להיכנס לנקבוביות נעות במרחק הקצר ביותר דרך העמוד. כל מין עם משקל מולקולרי מעל "מגבלת אי הכללה" זו ייצא מהטור בו זמנית. מולקולות קטנות מספיק כדי להיכנס בחופשיות לנקבוביות יישמרו הכי הרבה זמן, ויצאו מהטור יחד. המשקל המולקולרי המאפשר כניסת נקבובית מלאה הוא "מגבלת החלחלות".
רק מולקולות בין גבולות אלה יופרדו זו מזו, שכן הן מבלות כמויות משתנות של זמן בהתפזרות לתוך הנקבוביות ומחוצה להן. מולקולות קטנות יותר נשמרות זמן רב יותר על העמודה מכיוון שהן מבלות יותר זמן בשלב הנייח, בעוד שמולקולות גדולות יותר בגבולות אלה יוצאות מוקדם יותר.
משקלים מולקולריים על פני 1 עד 2 סדרי גודל נופלים בגבולות אלה. עמודות נבחרות מתוך מחשבה זו, או שניתן להשתמש בעמודות מרובות בסידרה אם קיים מגוון רחב של תרכובות רצויות.
עכשיו שראיתם את התיאוריה של הרשות לניירות ערך, בואו נראה איך זה מתבצע.
כדי להתחיל בהליך ה- SEC, יש לשקם את העמודה עם מאגר מים וכרומטוגרפיה דה-יונים. לאחר ההכנה, המאגר המכיל את המדגם מוזרק לעמודה. לאחר מכן, המאגר נדחף פנימה בקצב זרימה נמוך. גלאי מנטר את היציאה מהעמודה כדי לקבוע את נוכחות הניתוח הרצוי. מולקולות גדולות עם משקולות מולקולריות מעל מגבלת ההדרה יוצאות מהעמודה בו זמנית. שברים קטנים מהעמודה נאספים בצינורות. כל שבר נבדק לאיכות מולקולת היעד על ידי אלקטרופורזה ג'ל או טכניקות אנליטיות אחרות.
עכשיו בואו נסתכל על כרומטוגרפיה של זיקה או AC, אחת הדרכים היעילות ביותר לטהר חלבונים. ביומולקולים רבים נקשרים באופן סלקטיבי לנכסים מסוימים - A אשר AC משתמש בו על ידי דבקות בליגנד ספציפי למטרה לשלב הנייח.
כאשר התערובת זורמת דרך העמודה, מולקולות היעד מתחברות לליגנד, והשאר זורמות פנימה. לאחר שהתערובת עברה דרך הטור, ניתן לאסוף את מולקולת היעד באמצעות אחת משתי שיטות עילום המבוססות על ספציפיות.
האלה ביו-פיספית יכולה להיאמר שיש לה "תפקיד נורמלי" או "הפוך". בהתבררות ביו-פסיפית בעלת תפקיד רגיל, מתווסף סוכן שמתחרה בליגנד הדבוק כדי להיקשר לביומולקול היעד.
בהתבררות ביו-פיספית של תפקיד הפוך, סוכן מתחרה במטרה להיקשר לליגנד הדבוק. סוג ההחמקה השני, ההבהרה הלא-מינית , מוריד את איגוד היעד לליגנד על ידי שינוי ה- pH, הכוח היוני או הקוטביות של הפתרון. אם חלבון אינו נקשר לליגנד שניתן לשתק, ניתן לבטא את החלבון המכיל "תג": רצפי פפטיד קצרים שתוכננו להיקשר לליגנד.
מגוון אחד הוא כרומטוגרפיה של זיקת יון מתכת משותקת, "IMAC" בקיצור, שם ליגנד מתכת דבק, כמו ניקל או קובלט, נקשר לשאריות היסטידין על החלבון המותאם. באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית, חלבוני היעד נוצרים עם שאריות היסטידין חוזרות, הנקראות תג פוליהיסטידין, הנקשר למתכת באמצעות שרשרת הצד של האימידזול על היסטידין. לאחר ההוגנה, ניתן לאסוף את החלבון עם imidazole חינם באמצעות elution ספציפי תפקיד הפוך ולאחר מכן משמש במגוון רחב של יישומים במורד הזרם. עכשיו שראיתם את התיאוריה של כרומטוגרפיה של זיקה, בואו נסתכל על הליך IMAC במעבדה.
ב- IMAC, ניתן להוסיף את השלב הנייח ישירות לתערובת של שלב נייד מדגם, המאפשר את הכריכה של החלבון המתויג שלו. אז פסולת זו נשפכת לתוך הטור, שבו התרכובות שאינן קשורות מטפטפות לפסולת, בעוד הפסולת נשארת. מיכל תרחיף הוא שטף כדי לאסוף שאריות שרף ודגימה, אשר מתווסף לעמודה.
השרף מעורבב כדי להבטיח את הרכיבים הלא מאוגדים זורמים בחופשיות. מאגר כביסה נוסף מסייע לשטוף אותם. לאחר שכל הרכיבים הלא מאוגדים הוסרו, הפסולת מוחלפת במיכל לאיסוף חלבון היעד.
חוצץ המכיל imidazole מתווסף, מעורבב, ומותר לנוח כדי unbind מולקולת היעד. האימידזול נקשר למתכת, מחליף ומשחרר את החלבון המתויג. החלבון המשוחרר נאסף, וצעד האימידזול חוזר על עצמו כדי להבטיח איסוף כולל. כדי להמשיך לטהר את המדגם, ניתן להפעיל את SEC על המדגם לפני הניתוח.
עכשיו שראינו את התיאוריה והנוהל של שתי הטכניקות האלה, בואו נסתכל על כמה מהדרכים שבהן הן מיושמות בתחום הביוכימי.
סיבה נפוצה לטהר חלבונים היא ללמוד את תפקידם במחלות. סיסטיק פיברוזיס נגרמת על ידי פגמים בחלבון הרגולטור מוליכות טרנסמברן סיסטיק פיברוזיס, או CFTR. לאחר גידול החלבון עם תג שלו בשמרים, הן זיקה והן כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל מאפשרות בידוד של החלבון, ואחריו חקר תפקידו.
במקרים מסוימים, נוכחות של תג פוליהיסטידין יכול לשנות את המבנה של חלבון, ובכך להשפיע על תפקודו. תג נפוץ נוסף הוא חלבון מחייב מלטוז או MBP, אשר ייקשר עמילוז מאוגד בעמודה. לאחר מכן משמש מלטוז לשחרור המתחם. לאחר מכן ניתן לבקע את ה- MBP ולהסיר אותו עם SEC כדי לייצר את החלבון הרצוי הטהור.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על מידה-הדרה וכרומטוגרפיה של זיקה. הוא כיסה את התיאוריה של הטכניקות, עבר על הליכים כלליים, וכיסה חלק מהשימושים בטכניקות.
תודה שצפיתם!
Procedure
בביוכימיה, שיטות טיהור מבוססות כרומטוגרפיה משמשות כדי לבודד תרכובות מתערובת מורכבת. שתי שיטות כאלה המשמשות בדרך כלל על ידי ביוכימאים הן כרומטוגרפיה גודל-הדרה וכרומטוגרפיה זיקה. בכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל, עמודה עמוסה חרוזים נקבוביים מפרידה בין רכיבים של תערובת בהתבסס על גודל. מצד שני, כרומטוגרפיה של זיקה מאפשרת הפרדה ספציפית יותר של ביומולקולים באמצעות עמודה המורכבת משלב נייח, המכיל ליגנדים ספציפיים למטרה.
וידאו זה משמש מבוא לכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל וזיקה, כמו גם למושגים השולטים בהם. הליך שלב אחר שלב לטיהור של חלבון מתויג היסטידין על ידי כרומטוגרפיה זיקה מתכתית משותקת מתואר. יישומים עבור שתי שיטות כרומטוגרפיות אלה בביוכימיה ומחקר ביו-רפואי הם גם פרופיל.
"כרומטוגרפיה" מתייחס למגוון רחב של שיטות המשמשות לבידוד רכיב מתערובת מורכבת, צעד חיוני לפני שניתן לקבוע את תכונותיו ופעילותו של הביו-מוקולקול. לכל טכניקה כרומטוגרפית יש מנגנון שונה להפרדה, בהתאם למטריקס לדוגמה ולתרכובת היעד. וידאו זה יתמקד בעקרונות ובתפעול של שתי שיטות המשותפות לביוכימיה: מידה-הדרה וכרומטוגרפיה של זיקה.
כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל או SEC מבוססת על גודל התרכובות במדגם. שלב נייד המכיל את המדגם נוסף לעמודה עם חומר נקבובי: השלב הנייח. המולקולות במדגם מתחלקות ל-1 מתוך 3 קטגוריות.
מולקולות גדולות מכדי להיכנס לנקבוביות נעות במרחק הקצר ביותר דרך העמוד. כל מין עם משקל מולקולרי מעל "מגבלת אי הכללה" זו ייצא מהטור בו זמנית. מולקולות קטנות מספיק כדי להיכנס בחופשיות לנקבוביות יישמרו הכי הרבה זמן, ויצאו מהטור יחד. המשקל המולקולרי המאפשר כניסת נקבובית מלאה הוא "מגבלת החלחלות".
רק מולקולות בין גבולות אלה יופרדו זו מזו, שכן הן מבלות כמויות משתנות של זמן בהתפזרות לתוך הנקבוביות ומחוצה להן. מולקולות קטנות יותר נשמרות זמן רב יותר על העמודה מכיוון שהן מבלות יותר זמן בשלב הנייח, בעוד שמולקולות גדולות יותר בגבולות אלה יוצאות מוקדם יותר.
משקלים מולקולריים על פני 1 עד 2 סדרי גודל נופלים בגבולות אלה. עמודות נבחרות מתוך מחשבה זו, או שניתן להשתמש בעמודות מרובות בסידרה אם קיים מגוון רחב של תרכובות רצויות.
עכשיו שראיתם את התיאוריה של הרשות לניירות ערך, בואו נראה איך זה מתבצע.
כדי להתחיל בהליך ה- SEC, יש לשקם את העמודה עם מאגר מים וכרומטוגרפיה דה-יונים. לאחר ההכנה, המאגר המכיל את המדגם מוזרק לעמודה. לאחר מכן, המאגר נדחף פנימה בקצב זרימה נמוך. גלאי מנטר את היציאה מהעמודה כדי לקבוע את נוכחות הניתוח הרצוי. מולקולות גדולות עם משקולות מולקולריות מעל מגבלת ההדרה יוצאות מהעמודה בו זמנית. שברים קטנים מהעמודה נאספים בצינורות. כל שבר נבדק לאיכות מולקולת היעד על ידי אלקטרופורזה ג'ל או טכניקות אנליטיות אחרות.
עכשיו בואו נסתכל על כרומטוגרפיה של זיקה או AC, אחת הדרכים היעילות ביותר לטהר חלבונים. ביומולקולים רבים נקשרים באופן סלקטיבי לנכסים מסוימים - A אשר AC משתמש בו על ידי דבקות בליגנד ספציפי למטרה לשלב הנייח.
כאשר התערובת זורמת דרך העמודה, מולקולות היעד מתחברות לליגנד, והשאר זורמות פנימה. לאחר שהתערובת עברה דרך הטור, ניתן לאסוף את מולקולת היעד באמצעות אחת משתי שיטות עילום המבוססות על ספציפיות.
האלה ביו-פיספית יכולה להיאמר שיש לה "תפקיד נורמלי" או "הפוך". בהתבררות ביו-פסיפית בעלת תפקיד רגיל, מתווסף סוכן שמתחרה בליגנד הדבוק כדי להיקשר לביומולקול היעד.
בהתבררות ביו-פיספית של תפקיד הפוך, סוכן מתחרה במטרה להיקשר לליגנד הדבוק. סוג ההחמקה השני,ההבהרה הלא-מינית, מוריד את איגוד היעד לליגנד על ידי שינוי ה- pH, הכוח היוני או הקוטביות של הפתרון. אם חלבון אינו נקשר לליגנד שניתן לשתק, ניתן לבטא את החלבון המכיל "תג": רצפי פפטיד קצרים שתוכננו להיקשר לליגנד.
מגוון אחד הוא כרומטוגרפיה של זיקת יון מתכת משותקת, "IMAC" בקיצור, שם ליגנד מתכת דבק, כמו ניקל או קובלט, נקשר לשאריות היסטידין על החלבון המותאם. באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית, חלבוני היעד נוצרים עם שאריות היסטידין חוזרות, הנקראות תג פוליהיסטידין, הנקשר למתכת באמצעות שרשרת הצד של האימידזול על היסטידין. לאחר ההוגנה, ניתן לאסוף את החלבון עם imidazole חינם באמצעות elution ספציפי תפקיד הפוך ולאחר מכן משמש במגוון רחב של יישומים במורד הזרם. עכשיו שראיתם את התיאוריה של כרומטוגרפיה של זיקה, בואו נסתכל על הליך IMAC במעבדה.
ב- IMAC, ניתן להוסיף את השלב הנייח ישירות לתערובת של שלב נייד מדגם, המאפשר את הכריכה של החלבון המתויג שלו. אז פסולת זו נשפכת לתוך הטור, שבו התרכובות שאינן קשורות מטפטפות לפסולת, בעוד הפסולת נשארת. מיכל תרחיף הוא שטף כדי לאסוף שאריות שרף ודגימה, אשר מתווסף לעמודה.
השרף מעורבב כדי להבטיח את הרכיבים הלא מאוגדים זורמים בחופשיות. מאגר כביסה נוסף מסייע לשטוף אותם. לאחר שכל הרכיבים הלא מאוגדים הוסרו, הפסולת מוחלפת במיכל לאיסוף חלבון היעד.
חוצץ המכיל imidazole מתווסף, מעורבב, ומותר לנוח כדי unbind מולקולת היעד. האימידזול נקשר למתכת, מחליף ומשחרר את החלבון המתויג. החלבון המשוחרר נאסף, וצעד האימידזול חוזר על עצמו כדי להבטיח איסוף כולל. כדי להמשיך לטהר את המדגם, ניתן להפעיל את SEC על המדגם לפני הניתוח.
עכשיו שראינו את התיאוריה והנוהל של שתי הטכניקות האלה, בואו נסתכל על כמה מהדרכים שבהן הן מיושמות בתחום הביוכימי.
סיבה נפוצה לטהר חלבונים היא ללמוד את תפקידם במחלות. סיסטיק פיברוזיס נגרמת על ידי פגמים בחלבון הרגולטור מוליכות טרנסמברן סיסטיק פיברוזיס, או CFTR. לאחר גידול החלבון עם תג שלו בשמרים, הן זיקה והן כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל מאפשרות בידוד של החלבון, ואחריו חקר תפקידו.
במקרים מסוימים, נוכחות של תג פוליהיסטידין יכול לשנות את המבנה של חלבון, ובכך להשפיע על תפקודו. תג נפוץ נוסף הוא חלבון מחייב מלטוז או MBP, אשר ייקשר עמילוז מאוגד בעמודה. לאחר מכן משמש מלטוז לשחרור המתחם. לאחר מכן ניתן לבקע את ה- MBP ולהסיר אותו עם SEC כדי לייצר את החלבון הרצוי הטהור.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על מידה-הדרה וכרומטוגרפיה של זיקה. הוא כיסה את התיאוריה של הטכניקות, עבר על הליכים כלליים, וכיסה חלק מהשימושים בטכניקות.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
