Overview
In der Biochemie werden Chromatographie-basierte Reinigungsverfahren eingesetzt, um Verbindungen aus einer komplexen Mischung zu isolieren. Zwei solche Methoden, die von Biochemikern allgemein verwendet sind Größe-Ausschluss-Chromatographie und Affinitätschromatographie. Größe-Ausschluss-Chromatographie trennt eine Spalte verpackt mit porösen Korne Bestandteile einer Mischung abhängig von der Größe. Auf der anderen Seite ermöglicht eine genauere Trennung von Biomolekülen Affinitätschromatographie mithilfe einer Spalte, die der stationären Phase besteht die zielspezifischen Liganden enthält.
Dieses Video dient als Einführung in die Größe-Ausgrenzung und Affinitätschromatographie sowie die Konzepte, die sie regieren. Eine schrittweise Anleitung für die Reinigung von einem Histidin-markierten Protein von immobilisierten Metall Affinitätschromatographie wird beschrieben. Anwendungen für beide chromatographischen Methoden der Biochemie und biomedizinischer Forschung werden auch profiliert.
"Chromatographie" bezieht sich auf eine Vielzahl von Methoden verwendet, um eine Komponente aus einer komplexen Mischung, ein wesentlicher Schritt, bevor ein Biomolekül Eigenschaften und Aktivitäten bestimmt werden können zu isolieren. Jede chromatographische Technik hat einen anderen Mechanismus für die Trennung, abhängig von der Probenmatrix und Zielsubstanz. Dieses Video konzentriert sich auf die Grundsätze und den Betrieb von zwei Methoden üblich, Biochemie: Größe-Ausgrenzung und Affinität Chromatographie.
Größe-Ausschluss-Chromatographie oder SEC basiert auf der Größe der Verbindungen in der Probe. Eine mobile Phase mit der Probe wird hinzugefügt, um eine Spalte mit einem porösen Material: der stationären Phase. Die Moleküle in der Probe fallen in 1 von 3 Kategorien.
Moleküle zu groß, um die Poren zu geben Reisen die kürzeste Verbindung durch die Säule. Jede Spezies mit einem Molekulargewicht über diese "Ausgrenzung Grenze" wird die Spalte gleichzeitig beendet. Moleküle klein genug, um die Poren frei geben am längsten einbehalten werden und werden beendet die Spalte zusammen. Das Molekulargewicht ermöglicht komplette Pore Eintrag ist die "Permeation Grenze".
Nur Moleküle zwischen diesen Grenzen werden voneinander getrennt werden, da sie unterschiedliche Mengen an Zeit diffundieren in die und aus den Poren zu verbringen. Kleinere Moleküle sind mehr auf die Spalte beibehalten, weil sie mehr Zeit in der stationären Phase verbringen, während größere Moleküle innerhalb dieser Grenzen früher beenden.
Molekulargewichte über 1 bis 2 Größenordnungen fallen innerhalb dieser Grenzen. Spalten werden mit diesem im Verstand ausgewählt, oder mehrere Spalten können in Serie verwendet werden, wenn es eine breite Palette von gewünschten Verbindungen gibt.
Nun, da Sie die Theorie der SEC gesehen haben, schauen wir wie es durchgeführt wird.
Um die SEC-Vorgang zu starten, muss die Spalte mit entionisiertem Wasser und Chromatographie Puffer equilibriert. Nachdem vorbereitet, wird Puffer mit der Probe auf die Säule eingespritzt. Der Puffer wird dann mit einer low-Flow-Rate durch gedrückt. Ein Detektor überwacht, was die Spalte, um das Vorhandensein des gewünschten Analyten bestimmen beendet. Große Moleküle mit Molekulargewichten oberhalb der Ausgrenzung beenden die Spalte zur gleichen Zeit. Kleine Brüche in der Spalte werden in Röhren gesammelt. Jede Fraktion ist für die Qualität des Zielmoleküls durch Gelelektrophorese oder andere analytische Techniken getestet.
Nun werfen wir einen Blick auf Affinitätschromatographie oder AC, eines der effizientesten Mittel, Proteine zu reinigen. Viele Biomoleküle binden selektiv an bestimmte Liganden-a-Eigenschaft die AC nutzt durch die Einhaltung einer zielspezifischen Liganden an die stationäre Phase.
Wenn das Gemisch durch die Säule fließt, zuordnen Zielmoleküle der Liganden und der Rest Durchströmung. Nachdem die Mischung der Spalte durchlaufen hat, kann das Zielmolekül durch zwei Elution Methoden basierend auf Spezifität gesammelt werden.
Biospezifischen Elution kann man sagen, ein haben eine "Normal" oder "Reverse-Rolle". In Normal-Rolle biospezifischen Elution ist ein Agent hinzugefügt, die mit der eingehalten Liganden binden mit dem Ziel Biomolekül konkurriert.
Im Gegenteil-Rolle biospezifischen Elution konkurriert ein Agent mit dem Ziel, an dem eingehalten Liganden binden. Die zweite Art der Elution, unspezifische Elution, senkt die Ziel-Ligand-Bindung durch eine Änderung der Lösung pH, Ionenstärke oder Polarität. Wenn ein Protein nicht zu einem Liganden bindet, die immobilisiert werden kann, das Protein kann ausgedrückt werden mit einem "Tag": kurze Peptid-Sequenzen entwickelt, um an den Liganden binden.
Eine Sorte ist stillgestellte Metallionen Affinitätschromatographie, "IMAC" kurz, wo eine haftende Metall Liganden, wie Nickel oder Kobalt, Histidin Rückstände auf das veränderte Protein bindet. Durch molekularbiologische Techniken entstehen Zielproteine mit sich wiederholenden Histidin Rückstände, Polyhistidine-Tag genannt, die das Metall über den Imidazol-Seitenkette auf Histidin bindet. Einmal gebunden, das Protein kann mit kostenlosen Imidazol per Reverse-Rolle bestimmte Elution gesammelt werden und später in eine Vielzahl von downstream-Anwendungen verwendet.
Nun, da Sie die Theorie der Affinitätschromatographie gesehen haben, schauen Sie sich bitte an ein IMAC-Verfahren im Labor.
IMac kann die stationäre Phase direkt auf die Mischung der mobilen Phase und Probe, so dass die Bindung des sein-tagged Proteins hinzugefügt werden. Dieser Brei wird dann in der Spalte "" gegossen wo die nicht gebundenen Tropf zu Abfall, Verbindungen während die Gülle bleibt. Die Gülle-Container wird gespült, sammle restliche Harz und Muster, die die Spalte hinzugefügt wird.
Das Harz wird gerührt, um sicherzustellen, dass die ungebundenen Komponenten frei fließend sind. Hinzugefügt von Waschanlagen Puffer hilft ihnen weg spülen. Sobald alle ungebundenen Bestandteile entfernt wurden, wird die Abfälle mit einem Container zu sammeln, das Zielprotein ersetzt.
Puffer mit Imidazol wird hinzugefügt, gerührt und Ruhe um das Zielmolekül trennen durfte. Die Imidazol bindet an das Metall, ersetzen und die Freigabe der tagged Proteins. Das befreite Protein wird gesammelt und der Imidazol-Schritt wird wiederholt, um die gesamte Kollektion zu gewährleisten. Um die Probe weiter zu reinigen, kann SEC auf die Probe vor der Analyse ausgeführt werden.
Nun, da wir die Theorie und das Verfahren dieser beiden Techniken gesehen haben, betrachten wir einige der Möglichkeiten, wie, die Sie im biochemischen Bereich angewendet werden.
Ein häufiger Grund, Proteine zu reinigen ist, ihre Rolle in der Krankheit zu studieren. Mukoviszidose wird durch Mängel in der Mukoviszidose transmembranen Leitwert Regler Protein oder CFTR verursacht. Nach einem Wachstum des Proteins mit einem his-Tag in der Hefe, ermöglichen Affinität und Größe-Ausschluss Chromatographie die Isolierung des Proteins, gefolgt von der Studie seiner Funktion.
In einigen Fällen kann das Vorhandensein eines Polyhistidine-Tags eine Proteinstruktur und beeinträchtigt dadurch seine Funktion ändern. Eine weitere gemeinsame Tag ist Maltose-bindende Protein oder MBP, die Amylose in einer Spalte gebunden binden wird. Maltose wird dann verwendet, um den Komplex zu lösen. MBP kann dann gespalten und entfernt bei SEC, reine gewünschten Proteins zu produzieren.
Sie habe nur Jupiters Video-on-Größe-Ausgrenzung und Affinität Chromatographie beobachtet. Es bedeckt die Theorie der Techniken, ging über allgemeine Verfahren und behandelt einige der Anwendungen der Techniken.
Danke fürs Zuschauen!
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