Ultracentrifugation en gradient de densité

Ultracentrifugation gradient de densité est une approche commune pour isoler et purifier les structures cellulaires pour expériences biochimiques. La technique utilise une centrifugeuse à grande vitesse, ou ultra, pour séparer les composantes cellulaires dans un gradient de densité non destructive. Cette vidéo décrit les principes d’ultracentrifugation gradient de densité, prévoit une procédure générale en utilisant un gradient de sucrose et discute de certaines applications.

Commençons par examiner les principes des ultracentrifugeuses et gradients de densité. Une suspension contient des particules dans un solvant liquid. En raison de la gravité, les particules plus denses que les sédiments de solvant dehors tandis que ceux moins denses que le flotteur de solvant. Plus la différence de densité entre la particule et le solvant, plus vite la séparation.

Une ultracentrifugeuse contient une unité appelée rotor, qui tourne à des vitesses hautement contrôlés, simulant un fort champ gravitationnel. Dans ce domaine, les différences de densité entre les particules et le solvant sont amplifiés.

La force du champ dépend de la vitesse de rotation. Même un petit rotor à une vitesse de rotation relativement faible peut créer une force de milliers de fois plus forte que le champ gravitationnel de la terre.

Si le tube contient plusieurs liquides de densités différentes, centrifugation les gardera en couches séparées par ordre de densité, avec le liquide plus dense plus proche de la base. Telle une stratification de plusieurs liquides est appelée un « gradient de densité ». Il existe deux types. À l’étape dégradés, de diminution de densité des liquides sont soigneusement en couches sur le dessus, un de l’autre. Dans des gradients continus, les liquides sont mélangés dans des proportions variables, donc la densité diminue en douceur de la base vers le haut.

Organites cellulaires peuvent être séparés en utilisant un gradient de l’étape, par le biais de « centrifugation de gradient de densité isopycnique. » Il s’agit de la procédure plus simple et la plus courante de centrifugation.

Cette procédure est utilisée pour séparer les structures cellulaires. Le plus dense l’organite, plus il descend-avec les mitochondries en haut et en acides nucléiques vers le bas.

Maintenant que vous connaissez les principes qui sous-tendent la technique, nous allons le voir dans le laboratoire.

Avant que la procédure est engagée, cotes de vitesse et de la densité du fabricant est à noter, l’ultracentrifugeuse vérifier et la corrosion. Cette procédure utilise un rotor oscillant-seau.

Tout d’abord, la substance cellulaire est préparé par l’homogénéisation des cellules, qui libère non destructive de leurs organites. L’homogénat peut être fractionnée par centrifugation à basse vitesse préliminaire, pour supprimer les composants de faible densités. Ensuite, les solutions de saccharose sont préparées.

Saccharose est ajouté en quantités croissantes ainsi chaque solution est plus concentré et donc plus dense, que la précédente. La densité exacte des solutions dépendront les composants soient séparées, qui peuvent varier entre les organismes. Les solutions devraient avoir des densités entre celles des composants à être séparés, avec la dernière solution plus dense que le composant le plus dense de l’analyte. Techniques de séparation des composants plus denses que le saccharose, comme les acides nucléiques, sont décrites dans les demandes.

Le gradient de saccharose est maintenant créé dans un tube à centrifuger propre. Une pipette est utilisée pour élaborer la solution plus concentrée de saccharose. Avec le tube qui s’est tenu debout, l’embout de la pipette est placé contre le mur, et le liquide distribué régulièrement vers le bas. Il est important que la zone de travail est exempte de vibrations et d’autres perturbations.

Après avoir remplacé la pointe, les solutions restantes sont ajoutées dans l’ordre décroissant de densité. Ils sont distribués avec soin pour former des couches distinctes et éviter de mélanger. Enfin, environ la moitié d’un millilitre de l’échantillon cellulaire est ajouté au sommet de la pente, et le tube est pesé. Il sert à équilibrer la répartition du poids, la prochaine étape du processus.

Centrifugation doit commencer dès que possible. Le tube est placé dans le rotor, qui est alors équilibré en plaçant des solutions flans de poids égal en s’opposant à fentes. Le rotor est placé dans l’ultracentrifugation et le système scellé. La vitesse de rotation et de la température et l’heure sont définies. Valeurs typiques sont de 4 ° C, avec une force de plus 100 000 x g pendant 16 h.

Après centrifugation, le tube est retiré du rotor, en prenant soin du pour tenir debout et non perturbée. Les différents composants cellulaires ont fractionnés en bandes discrètes entre les couches de la solution. Les fractions peuvent être enlevées avec une seringue. Alternativement, le fond du tube peut être percé avec une aiguille fine, stérilisée et les sorties de fonds collectés dans des tubes stériles. Les composants cellulaires ont été isolés. Ils peuvent être conservés à-80 ° C.

Maintenant que nous avons vu la procédure de base, nous allons étudier certaines applications.

Une application typique est l’isolement de plusieurs protéines complexes dans les cellules végétales. Dans cet exemple, complexes responsables de flux d’électrons cycliques sont être isolés depuis les thylakoïdes, le site de la réaction de la lumière dans la photosynthèse. Cette procédure utilise des solutions discrètes de 14 à 45 % de saccharose. Centrifugation produit de plus 100 000 x g pendant 14 h à 4 ° C.

Parce que les acides nucléiques sont plus denses que le saccharose, centrifugation isopycnique ne peut les séparer des organelles non destructive.

Une technique différente, appelée « centrifugation zonale-taux » est utilisée. Il sépare les organites basés sur leur taux de sédimentation, dont dépendent non seulement sur leur densité, mais aussi sur leurs conformations. Un gradient continu est utilisé pour séparer les composants basés sur cette propriété.

Les étapes de la procédure sont semblables à celles des cas isopycnique. Dans cet exemple, les complexes de RNA-ribosomes sont isolées à l’aide d’un gradient continu de 5 % à 20 %, centrifugés à 230 000 x g. Centrifugation est interrompue après quelques heures pour empêcher la coprécipitation.

Brins d’acide nucléique peuvent être séparés les uns des autres sur la base de la densité.

C’est parce que les brins riche en guanine et cytosine sont plus denses que ceux riches en adénine et de la thiamine. Dans ce cas, la pente ne peut faire de saccharose, saccharose étant moins dense que les acides nucléiques. Au lieu de cela, des gradients de chlorure de césium, généralement à partir de 1,65 à 1,75 g/mL sont utilisés, car ils ont une densité suffisante et une faible viscosité.

Nous voyons ici le plancton ADN étant purifié à l’aide d’un gradient de chlorure de césium continue. Centrifugation se produit à plus 1 000 000 x g pendant 18 h sous vide.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur ultracentrifugation avec un gradient de densité de saccharose. Vous devez maintenant comprendre comment fonctionne un gradient de densité, la construction d’un gradient de l’étape et comment charger et utiliser une ultracentrifugeuse. Merci de regarder !