Overview
אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות היא טכניקה נפוצה המשמשת לבודד ולטהר ביומולקולים ומבני תאים. טכניקה זו מנצלת את העובדה כי, בהשעיה, חלקיקים צפופים יותר מאשר הממס יהיה מ משקעים, בעוד אלה כי הם פחות צפופים יצוף. אולטרה-צנטריפוגה במהירות גבוהה משמשת להאצת תהליך זה על מנת להפריד ביומולקולים בתוך שיפוע צפיפות, אשר ניתן להקים על ידי שכבות נוזלים של ירידה בצפיפות בצינור צנטריפוגה.
הסרטון יכסה את העקרונות של אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות, כולל הליך המדגים הכנת מדגם, יצירת שיפוע סוכרוז, אולטרה-צנטריפוגה ואיסוף של ניתוחים חלקיים. סעיף היישומים דן בבידוד של מתחמים מרובי חלבונים, בידוד מתחמי חומצת גרעין והפרדה באמצעות שיפועי צפיפות צסיום כלוריד.
אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות היא גישה נפוצה לבודד ולטהר מבני תאים לניסויים ביוכימיים. הטכניקה משתמשת בצנטריפוגה במהירות גבוהה, או אולטרה, כדי להפריד באופן לא מבני רכיבים סלולריים במעבר צבע בצפיפות. וידאו זה מתאר את העקרונות של אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, מספק הליך כללי באמצעות מעבר צבע סוכרוז, ודן ביישומים מסוימים.
נתחיל בבחינת העקרונות של שיפועי אולטרה-צנטריפוגות וצפיפות. השעיה מכילה חלקיקים בממס נוזלי. בגלל כוח המשיכה, חלקיקים צפופים יותר מאשר משקעים ממס החוצה בעוד אלה פחות צפוף מאשר ממס לצוף. כך גדל ההבדל בצפיפות בין החלקיק לממס, כך ההפרדה מהירה יותר.
אולטרה-צנטריפוגה מכילה יחידה הנקראת רוטור, המסתובבת במהירויות מבוקרות מאוד, המדמה שדה כבידה חזק. בתוך שדה זה, ההבדלים בצפיפות בין החלקיקים לבין הממס מוגדלים.
כוח השדה תלוי במהירות הסיבוב. אפילו רוטור קטן במהירות סיבובית נמוכה יחסית יכול ליצור כוח חזק פי אלף משדה הכבידה של כדור הארץ.
אם צינור מכיל מספר נוזלים בצפיפות שונה, צנטריפוגה תשמור אותם בשכבות נפרדות לפי סדר הצפיפות, כאשר הנוזל הצפוף ביותר קרוב לבסיס. שכבות כאלה של נוזלים מרובים נקראות "שיפוע צפיפות". ישנם שני סוגים. במעברי צבע שלב, נוזלים של צפיפות פוחתת הם בשכבות בקפידה אחד על השני. בשיפועים רציפים, הנוזלים מעורבים בממדים שונים, כך שהצפיפות יורדת בצורה חלקה מהבסיס כלפי מעלה.
ניתן להפריד אברונים תאיים באמצעות מעבר צבע צעד, באמצעות "צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות איזופינית". זהו הליך המרכז הפשוט והנפוץ ביותר.
הליך זה משמש להפרדת המבנים התאיים. ככל שהאברון צפוף יותר, כך הוא יורד - עם מיטוכונדריה בחלק העליון וחומצות גרעין לכיוון הקרקעית.
עכשיו שאתה יודע את העקרונות מאחורי הטכניקה, בואו נראה את זה במעבדה.
לפני תחילת ההליך, יש לציין את דירוגי המהירות והצפיפות של היצרן, ואת ultracentrifuge בדק קורוזיה. הליך זה משתמש רוטור דלי מתנדנד.
ראשית, החומר התאי מוכן על ידי הומוגניזציה התאים, אשר משחרר באופן לא מבני את האברונים שלהם. הומוגנט עשוי להיות מופרד באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה ראשונית, כדי להסיר רכיבים בצפיפות נמוכה. לאחר מכן, פתרונות סוכרוז מוכנים.
סוכרוז מתווסף בכמויות הולכות וגדלות כך שכל פתרון מרוכז יותר, ולכן צפוף יותר מקודמו. הצפיפות המדויקת של הפתרונות תהיה תלויה ברכיבים שיש להפריד, המשתנים בין אורגניזמים. הפתרונות צריכים להיות צפיפות בין אלה של הרכיבים להיות מופרדים, עם הפתרון האחרון צפוף יותר מאשר המרכיב הצפוף ביותר של הניתוח. טכניקות להפרדת רכיבים צפופים יותר סוכרוז, כמו חומצות גרעין, מתוארות ביישומים.
שיפוע סוכרוז נוצר כעת בצינור צנטריפוגה נקי. פיפטה משמשת כדי לצייר את פתרון סוכרוז המרוכז ביותר. כשהצינור מוחזק זקוף, קצה הפיפטה ממוקם גבוה על הקיר, והנוזל מתחלק בהתמדה כלפי מטה. חשוב שאזור העבודה יישאר נקי מתנודות והפרעות אחרות.
לאחר החלפת הקצה, מוסיפים את הפתרונות הנותרים על מנת להקטין את הצפיפות. הם מחולקים בקפידה כדי ליצור שכבות נפרדות ולהימנע ערבוב. לבסוף, כחצי מיליליטר של המדגם הסלולר מתווסף על גבי השיפוע, ואת הצינור נשקל. זה משמש כדי לאזן את התפלגות המשקל, השלב הבא של התהליך.
צנטריפוגה צריכה להתחיל בהקדם האפשרי. הצינור ממוקם ברוטור, אשר מאוזן לאחר מכן על ידי הצבת פתרונות ריקים במשקל שווה בחריצים מנוגדים. הרוטור ממוקם ב האולטרה-צנטריפוגה והמערכת אטומה. הטמפרטורה ומהירות הסיבוב וזמן מוגדרים. ערכים אופייניים הם 4 °C (70 °F) עם כוח של מעל 100,000 x g עבור 16 שעות.
לאחר צנטריפוגה, הצינור הוא נסוג מן הרוטור, דואג לשמור אותו זקוף ולא מופרע. הרכיבים התאיים השונים מחולקים לפסים נפרדים בין שכבות הפתרון. ניתן לאסוף את השברים במזרק. לחלופין, ניתן לנקב את תחתית הצינור עם מחט מעוקרת עדינה ואת היציאה שנאספה בצינורות סטריליים. הרכיבים התאיים מבודדים כעת. הם יכולים להיות מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס.
עכשיו שראינו את ההליך הבסיסי, בואו נסתכל על כמה יישומים.
יישום טיפוסי הוא בידוד של מתחמי חלבון מרובים בתאי צמח. בדוגמה זו, מתחמים האחראים על זרימת אלקטרונים מחזוריים מבודדים מן thylakoid, האתר של תגובת האור בפוטוסינתזה. הליך זה משתמש בפתרונות נפרדים של 14 עד 45% סוכרוז. צנטריפוגה מתרחשת מעל 100,000 x g עבור 14 שעות ב 4 °C (70 °F).
מכיוון שצרידות גרעין צפופות יותר מ סוכרוז, צנטריפוגה איזופתית אינה יכולה להפריד ביניהן לאברונים באופן לא-טבעי.
טכניקה אחרת, המכונה "צנטריפוגה שיעור-zonal" משמש. הוא מפריד בין אברונים על סמך שיעורי המשפך שלהם, התלויים לא רק בצפיפות שלהם, אלא גם בקונפורציות שלהם. מעבר צבע רציף משמש להפרדת הרכיבים בהתבסס על מאפיין זה.
הצעדים הפרוצדורליים דומים לאלה של מקרים איזופיקים. בדוגמה זו, מתחמי ריבוזום RNA מבודדים באמצעות שיפוע רציף של 5% עד 20%, צנטריפוגות ב 230,000 x g. צנטריפוגה מופרעת לאחר מספר שעות כדי למנוע משקעים משותפים.
גדילי חומצת גרעין ניתן להפריד אחד מהשני על בסיס צפיפות.
הסיבה לכך היא גדילים עשירים גואנין וציטוצין צפופים יותר מאלה עשירים אדנין ותיאמין. במקרה זה, השיפוע לא יכול להיות עשוי סוכרוז, כי סוכרוז הוא פחות צפוף מאשר חומצות גרעין. במקום זאת, שיפועים צסיום כלוריד, בדרך כלל מ 1.65 כדי 1.75 גרם / מ"ל משמשים, שכן יש להם צפיפות מספקת וצמיגות נמוכה.
כאן אנו רואים דנ"א פלנקטון מטוהר באמצעות שיפוע צסיום כלוריד רציף. צנטריפוגה מתרחשת מעל 1,000,000 x g עבור 18 שעות תחת ואקום.
הרגע צפית בסרטון של JoVE על אולטרה-צנטריפוגה עם שיפוע צפיפות סוכרוז. כעת עליך להבין כיצד פועל מעבר צבע של צפיפות, כיצד לבנות מעבר צבע צעד וכיצד לטעון ולהפעיל אולטרה-צנטריפוגה. תודה שצפיתם!
Procedure
אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות היא טכניקה נפוצה המשמשת לבודד ולטהר ביומולקולים ומבני תאים. טכניקה זו מנצלת את העובדה כי, בהשעיה, חלקיקים צפופים יותר מאשר הממס יהיה מ משקעים, בעוד אלה כי הם פחות צפופים יצוף. אולטרה-צנטריפוגה במהירות גבוהה משמשת להאצת תהליך זה על מנת להפריד ביומולקולים בתוך שיפוע צפיפות, אשר ניתן להקים על ידי שכבות נוזלים של ירידה בצפיפות בצינור צנטריפוגה.
הסרטון יכסה את העקרונות של אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות, כולל הליך המדגים הכנת מדגם, יצירת שיפוע סוכרוז, אולטרה-צנטריפוגה ואיסוף של ניתוחים חלקיים. סעיף היישומים דן בבידוד של מתחמים מרובי חלבונים, בידוד מתחמי חומצת גרעין והפרדה באמצעות שיפועי צפיפות צסיום כלוריד.
אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות היא גישה נפוצה לבודד ולטהר מבני תאים לניסויים ביוכימיים. הטכניקה משתמשת בצנטריפוגה במהירות גבוהה, או אולטרה, כדי להפריד באופן לא מבני רכיבים סלולריים במעבר צבע בצפיפות. וידאו זה מתאר את העקרונות של אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, מספק הליך כללי באמצעות מעבר צבע סוכרוז, ודן ביישומים מסוימים.
נתחיל בבחינת העקרונות של שיפועי אולטרה-צנטריפוגות וצפיפות. השעיה מכילה חלקיקים בממס נוזלי. בגלל כוח המשיכה, חלקיקים צפופים יותר מאשר משקעים ממס החוצה בעוד אלה פחות צפוף מאשר ממס לצוף. כך גדל ההבדל בצפיפות בין החלקיק לממס, כך ההפרדה מהירה יותר.
אולטרה-צנטריפוגה מכילה יחידה הנקראת רוטור, המסתובבת במהירויות מבוקרות מאוד, המדמה שדה כבידה חזק. בתוך שדה זה, ההבדלים בצפיפות בין החלקיקים לבין הממס מוגדלים.
כוח השדה תלוי במהירות הסיבוב. אפילו רוטור קטן במהירות סיבובית נמוכה יחסית יכול ליצור כוח חזק פי אלף משדה הכבידה של כדור הארץ.
אם צינור מכיל מספר נוזלים בצפיפות שונה, צנטריפוגה תשמור אותם בשכבות נפרדות לפי סדר הצפיפות, כאשר הנוזל הצפוף ביותר קרוב לבסיס. שכבות כאלה של נוזלים מרובים נקראות "שיפוע צפיפות". ישנם שני סוגים. במעברי צבע שלב, נוזלים של צפיפות פוחתת הם בשכבות בקפידה אחד על השני. בשיפועים רציפים, הנוזלים מעורבים בממדים שונים, כך שהצפיפות יורדת בצורה חלקה מהבסיס כלפי מעלה.
ניתן להפריד אברונים תאיים באמצעות מעבר צבע צעד, באמצעות "צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות איזופינית". זהו הליך המרכז הפשוט והנפוץ ביותר.
הליך זה משמש להפרדת המבנים התאיים. ככל שהאברון צפוף יותר, כך הוא יורד - עם מיטוכונדריה בחלק העליון וחומצות גרעין לכיוון הקרקעית.
עכשיו שאתה יודע את העקרונות מאחורי הטכניקה, בואו נראה את זה במעבדה.
לפני תחילת ההליך, יש לציין את דירוגי המהירות והצפיפות של היצרן, ואת ultracentrifuge בדק קורוזיה. הליך זה משתמש רוטור דלי מתנדנד.
ראשית, החומר התאי מוכן על ידי הומוגניזציה התאים, אשר משחרר באופן לא מבני את האברונים שלהם. הומוגנט עשוי להיות מופרד באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה ראשונית, כדי להסיר רכיבים בצפיפות נמוכה. לאחר מכן, פתרונות סוכרוז מוכנים.
סוכרוז מתווסף בכמויות הולכות וגדלות כך שכל פתרון מרוכז יותר, ולכן צפוף יותר מקודמו. הצפיפות המדויקת של הפתרונות תהיה תלויה ברכיבים שיש להפריד, המשתנים בין אורגניזמים. הפתרונות צריכים להיות צפיפות בין אלה של הרכיבים להיות מופרדים, עם הפתרון האחרון צפוף יותר מאשר המרכיב הצפוף ביותר של הניתוח. טכניקות להפרדת רכיבים צפופים יותר סוכרוז, כמו חומצות גרעין, מתוארות ביישומים.
שיפוע סוכרוז נוצר כעת בצינור צנטריפוגה נקי. פיפטה משמשת כדי לצייר את פתרון סוכרוז המרוכז ביותר. כשהצינור מוחזק זקוף, קצה הפיפטה ממוקם גבוה על הקיר, והנוזל מתחלק בהתמדה כלפי מטה. חשוב שאזור העבודה יישאר נקי מתנודות והפרעות אחרות.
לאחר החלפת הקצה, מוסיפים את הפתרונות הנותרים על מנת להקטין את הצפיפות. הם מחולקים בקפידה כדי ליצור שכבות נפרדות ולהימנע ערבוב. לבסוף, כחצי מיליליטר של המדגם הסלולר מתווסף על גבי השיפוע, ואת הצינור נשקל. זה משמש כדי לאזן את התפלגות המשקל, השלב הבא של התהליך.
צנטריפוגה צריכה להתחיל בהקדם האפשרי. הצינור ממוקם ברוטור, אשר מאוזן לאחר מכן על ידי הצבת פתרונות ריקים במשקל שווה בחריצים מנוגדים. הרוטור ממוקם ב האולטרה-צנטריפוגה והמערכת אטומה. הטמפרטורה ומהירות הסיבוב וזמן מוגדרים. ערכים אופייניים הם 4 °C (70 °F) עם כוח של מעל 100,000 x g עבור 16 שעות.
לאחר צנטריפוגה, הצינור הוא נסוג מן הרוטור, דואג לשמור אותו זקוף ולא מופרע. הרכיבים התאיים השונים מחולקים לפסים נפרדים בין שכבות הפתרון. ניתן לאסוף את השברים במזרק. לחלופין, ניתן לנקב את תחתית הצינור עם מחט מעוקרת עדינה ואת היציאה שנאספה בצינורות סטריליים. הרכיבים התאיים מבודדים כעת. הם יכולים להיות מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס.
עכשיו שראינו את ההליך הבסיסי, בואו נסתכל על כמה יישומים.
יישום טיפוסי הוא בידוד של מתחמי חלבון מרובים בתאי צמח. בדוגמה זו, מתחמים האחראים על זרימת אלקטרונים מחזוריים מבודדים מן thylakoid, האתר של תגובת האור בפוטוסינתזה. הליך זה משתמש בפתרונות נפרדים של 14 עד 45% סוכרוז. צנטריפוגה מתרחשת מעל 100,000 x g עבור 14 שעות ב 4 °C (70 °F).
מכיוון שצרידות גרעין צפופות יותר מ סוכרוז, צנטריפוגה איזופתית אינה יכולה להפריד ביניהן לאברונים באופן לא-טבעי.
טכניקה אחרת, המכונה "צנטריפוגה שיעור-zonal" משמש. הוא מפריד בין אברונים על סמך שיעורי המשפך שלהם, התלויים לא רק בצפיפות שלהם, אלא גם בקונפורציות שלהם. מעבר צבע רציף משמש להפרדת הרכיבים בהתבסס על מאפיין זה.
הצעדים הפרוצדורליים דומים לאלה של מקרים איזופיקים. בדוגמה זו, מתחמי ריבוזום RNA מבודדים באמצעות שיפוע רציף של 5% עד 20%, צנטריפוגות ב 230,000 x g. צנטריפוגה מופרעת לאחר מספר שעות כדי למנוע משקעים משותפים.
גדילי חומצת גרעין ניתן להפריד אחד מהשני על בסיס צפיפות.
הסיבה לכך היא גדילים עשירים גואנין וציטוצין צפופים יותר מאלה עשירים אדנין ותיאמין. במקרה זה, השיפוע לא יכול להיות עשוי סוכרוז, כי סוכרוז הוא פחות צפוף מאשר חומצות גרעין. במקום זאת, שיפועים צסיום כלוריד, בדרך כלל מ 1.65 כדי 1.75 גרם / מ"ל משמשים, שכן יש להם צפיפות מספקת וצמיגות נמוכה.
כאן אנו רואים דנ"א פלנקטון מטוהר באמצעות שיפוע צסיום כלוריד רציף. צנטריפוגה מתרחשת מעל 1,000,000 x g עבור 18 שעות תחת ואקום.
הרגע צפית בסרטון של JoVE על אולטרה-צנטריפוגה עם שיפוע צפיפות סוכרוז. כעת עליך להבין כיצד פועל מעבר צבע של צפיפות, כיצד לבנות מעבר צבע צעד וכיצד לטעון ולהפעיל אולטרה-צנטריפוגה. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
