Overview
밀도 그라데이션 극심분리는 생체 분자및 세포 구조를 분리하고 정화하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다. 이 기술은 서스펜션에서 용매보다 밀도가 높은 입자가 퇴적물일 것이고, 밀도가 떨어지는 입자가 떠다니는 다는 사실을 악용합니다. 고속 초원심분리기는 원심분리관에서 밀도감소의 액체를 겹쳐서 확립할 수 있는 밀도 그라데이션 내에서 생체분자를 분리하기 위해 이 과정을 가속화하는 데 사용된다.
이 비디오는 샘플 준비, 자당 그라데이션 생성, 초원심 분리 및 분획된 별문 컬렉션을 보여주는 절차를 포함하여 밀도 그라데이션 초원심 분리의 원리를 다룹니다. 응용 분야는 다중 단백질 복합체의 분리, 핵산 복합체의 분리, 세슘 염화물 밀도 그라데이션을 사용하여 분리에 대해 설명합니다.
밀도 그라데이션 초원심분리는 생화학 실험을 위해 세포 구조를 분리하고 정화하는 일반적인 접근법입니다. 이 기술은 밀도 그라데이션에서 비파괴적으로 분리되는 세포 구성 요소를 위해 고속 또는 초원심분리기를 사용합니다. 이 비디오는 밀도 그라데이션 초원심분리의 원리를 설명하고, 자당 그라데이션을 사용하여 일반적인 절차를 제공하고, 일부 응용 프로그램에 대해 설명합니다.
먼저 초원심분리기와 밀도 그라데이션의 원리를 살펴보겠습니다. 현탁액에는 액체 용매의 입자가 포함되어 있습니다. 중력 때문에, 입자는 용매 퇴적물보다 밀도가 높지만 용매 부유물보다 밀도가 낮습니다. 입자와 용매 사이의 밀도 차이가 클수록 분리가 빨라집니다.
초원심분리기는 고도로 제어된 속도로 회전하는 로터라는 유닛이 포함되어 있어 강한 중력장을 시뮬레이션합니다. 이 분야 내에서 입자와 용매 간의 밀도 차이가 확대됩니다.
필드의 강도는 회전 속도에 따라 달라집니다. 비교적 낮은 회전 속도로 작은 로터조차도 지구의 중력장보다 수천 배 더 강한 힘을 만들 수 있습니다.
튜브에 다른 밀도의 여러 액체가 포함되어 있는 경우 원심 분리는 밀도 순으로 별도의 층으로 유지되며, 가장 조밀한 액체가 베이스에 가장 가깝습니다. 여러 액체의 이러한 계층화는 "밀도 그라데이션"이라고합니다. 두 가지 유형이 있습니다. 단계 그라데이션에서 밀도를 줄이는 액체는 조심스럽게 위에 겹쳐져 있습니다. 연속 그라데이션에서 액체는 다양한 비율로 혼합되므로 밀도가 베이스 위쪽에서 원활하게 감소합니다.
셀룰러 세포기관은 "이소피닉 밀도-그라데이션 원심 분리"를 통해 단계 그라데이션을 사용하여 분리될 수 있습니다. 이것은 가장 간단하고 가장 일반적인 원심 분리 절차입니다.
이 절차는 세포 구조를 분리하는 데 사용됩니다. 세포기관이 조밀할수록 상단에 미토콘드리아가 있고 핵산이 바닥을 향해 더 많이 내려갑니다.
이제 기술의 원리를 알고 있으므로 실험실에서 살펴보겠습니다.
절차가 시작되기 전에 제조업체의 속도와 밀도 등급을 주목해야 하며 초원심분리기는 부식을 검사했습니다. 이 절차는 스윙 버킷 로터를 사용합니다.
첫째, 세포 물질은 세포세포를 균질화하여 제조되며, 이는 비파괴적으로 세포기관을 방출한다. 균동형은 저밀도 성분을 제거하기 위해 예비 저속 원심분리를 통해 분획될 수 있다. 다음으로, 자당 솔루션이 준비됩니다.
자크로즈는 양을 늘려 서 각 솔루션이 이전 보다 더 집중되고 따라서 밀도가 높아지므로 더 조밀합니다. 솔루션의 정확한 밀도는 유기체마다 다른 분리되는 구성 요소에 따라 달라집니다. 솔루션은 분리할 구성 요소 들 간의 밀도가 있어야 하며, 마지막 솔루션은 분석물의 밀도가 높은 구성 요소보다 밀도가 높습니다. 핵산과 같은 자당보다 조밀한 성분을 분리하기 위한 기술은 응용 분야에서 설명된다.
자당 그라데이션은 이제 깨끗한 원심분리기 튜브로 만들어집니다. 파이펫은 가장 농축된 자당 용액을 그리는 데 사용됩니다. 튜브가 똑바로 세워져 서 파이펫 팁은 벽에 높게 배치되고 액체가 꾸준히 아래로 분배됩니다. 작업 영역은 진동 및 기타 장애에서 벗어나는 것이 중요합니다.
팁을 교체한 후 밀도를 줄이는 순서대로 나머지 솔루션이 추가됩니다. 그들은 뚜렷한 층을 형성하고 혼합을 피하기 위해 신중하게 분배됩니다. 마지막으로, 세포 샘플의 약 반 밀리리터가 그라데이션 위에 첨가되고 튜브의 무게가 커집니다. 이것은 프로세스의 다음 단계인 중량 분포의 균형을 맞추는 데 사용됩니다.
원심 분리는 가능한 한 빨리 시작되어야 합니다. 튜브는 로터에 배치되며, 반대 슬롯에 동일한 무게의 빈 솔루션을 배치하여 균형을 잡습니다. 로터는 초원심분리기및 시스템 밀봉에 배치됩니다. 온도와 회전 속도와 시간이 설정됩니다. 일반적인 값은 16h에 대해 100,000 x g 이상의 힘으로 4 °C입니다.
원심 분리 후 튜브는 로터에서 철수하여 똑바로 세워지고 방해받지 않도록 주의합니다. 다른 셀룰러 구성 요소는 솔루션 계층 사이의 개별 대역으로 분획되었습니다. 분수는 주사기로 수집할 수 있습니다. 또는 튜브의 바닥은 미세한 살균 된 바늘과 멸균 튜브에서 수집 된 유출로 구멍을 뚫을 수 있습니다. 셀룰러 구성 요소가 이제 격리되었습니다. 그들은 -80 °C에서 저장할 수 있습니다.
이제 기본 절차를 살펴보셨으니 일부 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.
일반적인 응용 프로그램은 식물 세포에서 다중 단백질 복합체의 분리입니다. 이 예에서, 순환 전자 흐름을 담당하는 복합체는 광합성에서 광반응의 현장인 틸라코이드로부터 분리되고 있다. 이 절차는 14~45%의 자당 솔루션을 사용합니다. 원심분리는 4°C에서 14시간 동안 100,000xg 이상 발생합니다.
핵산은 자당보다 밀도가 높기 때문에 이소피닉 원심분리는 비파괴적으로 세포기관과 분리할 수 없습니다.
"속도-구역 원심분리"라고 하는 다른 기술이 사용됩니다. 그것은 그들의 퇴적속도에 따라 세포기관을 분리, 이는 그들의 밀도에 의존, 뿐만 아니라 그들의 적합성에 의존. 연속 그라데이션은 이 속성을 기반으로 구성 요소를 분리하는 데 사용됩니다.
절차 단계는 이소피닉 케이스를 위한 것과 유사합니다. 이 예에서 RNA-리보솜 복합체는 5%에서 20%의 연속 그라데이션을 사용하여 격리되고, 원심분리는 230,000 x g로 분리된다. 원심분리는 강수량을 방지하기 위해 몇 시간 후에 중단됩니다.
핵산 가닥은 밀도에 기초하여 서로 분리될 수 있다.
구아닌과 사이토신이 풍부한 가닥은 아데닌과 티아민이 풍부한 가닥보다 밀도가 높기 때문입니다. 이 경우, 자당이 핵산보다 밀도가 낮기 때문에 그라데이션은 자당으로 만들 수 없습니다. 대신, 염화물 그라데이션세슘은 일반적으로 1.65에서 1.75 g/mL까지 충분한 밀도와 낮은 점도를 가지고 있기 때문에 사용됩니다.
여기서 우리는 플랑크톤 DNA가 연속적인 염화염화물 그라데이션을 사용하여 정제되는 것을 봅습니다. 원심분리는 진공 상태에서 18h의 경우 1,000,000 x g 이상으로 발생합니다.
자당 밀도 그라데이션으로 초원심 분리에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 이제 밀도 그라데이션의 작동 방식, 단계 그라데이션 을 구성하는 방법, 초원심분리기를 로드하고 작동하는 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
Procedure
밀도 그라데이션 극심분리는 생체 분자및 세포 구조를 분리하고 정화하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다. 이 기술은 서스펜션에서 용매보다 밀도가 높은 입자가 퇴적물일 것이고, 밀도가 떨어지는 입자가 떠다니는 다는 사실을 악용합니다. 고속 초원심분리기는 원심분리관에서 밀도감소의 액체를 겹쳐서 확립할 수 있는 밀도 그라데이션 내에서 생체분자를 분리하기 위해 이 과정을 가속화하는 데 사용된다.
이 비디오는 샘플 준비, 자당 그라데이션 생성, 초원심 분리 및 분획된 별문 컬렉션을 보여주는 절차를 포함하여 밀도 그라데이션 초원심 분리의 원리를 다룹니다. 응용 분야는 다중 단백질 복합체의 분리, 핵산 복합체의 분리, 세슘 염화물 밀도 그라데이션을 사용하여 분리에 대해 설명합니다.
밀도 그라데이션 초원심분리는 생화학 실험을 위해 세포 구조를 분리하고 정화하는 일반적인 접근법입니다. 이 기술은 밀도 그라데이션에서 비파괴적으로 분리되는 세포 구성 요소를 위해 고속 또는 초원심분리기를 사용합니다. 이 비디오는 밀도 그라데이션 초원심분리의 원리를 설명하고, 자당 그라데이션을 사용하여 일반적인 절차를 제공하고, 일부 응용 프로그램에 대해 설명합니다.
먼저 초원심분리기와 밀도 그라데이션의 원리를 살펴보겠습니다. 현탁액에는 액체 용매의 입자가 포함되어 있습니다. 중력 때문에, 입자는 용매 퇴적물보다 밀도가 높지만 용매 부유물보다 밀도가 낮습니다. 입자와 용매 사이의 밀도 차이가 클수록 분리가 빨라집니다.
초원심분리기는 고도로 제어된 속도로 회전하는 로터라는 유닛이 포함되어 있어 강한 중력장을 시뮬레이션합니다. 이 분야 내에서 입자와 용매 간의 밀도 차이가 확대됩니다.
필드의 강도는 회전 속도에 따라 달라집니다. 비교적 낮은 회전 속도로 작은 로터조차도 지구의 중력장보다 수천 배 더 강한 힘을 만들 수 있습니다.
튜브에 다른 밀도의 여러 액체가 포함되어 있는 경우 원심 분리는 밀도 순으로 별도의 층으로 유지되며, 가장 조밀한 액체가 베이스에 가장 가깝습니다. 여러 액체의 이러한 계층화는 "밀도 그라데이션"이라고합니다. 두 가지 유형이 있습니다. 단계 그라데이션에서 밀도를 줄이는 액체는 조심스럽게 위에 겹쳐져 있습니다. 연속 그라데이션에서 액체는 다양한 비율로 혼합되므로 밀도가 베이스 위쪽에서 원활하게 감소합니다.
셀룰러 세포기관은 "이소피닉 밀도-그라데이션 원심 분리"를 통해 단계 그라데이션을 사용하여 분리될 수 있습니다. 이것은 가장 간단하고 가장 일반적인 원심 분리 절차입니다.
이 절차는 세포 구조를 분리하는 데 사용됩니다. 세포기관이 조밀할수록 상단에 미토콘드리아가 있고 핵산이 바닥을 향해 더 많이 내려갑니다.
이제 기술의 원리를 알고 있으므로 실험실에서 살펴보겠습니다.
절차가 시작되기 전에 제조업체의 속도와 밀도 등급을 주목해야 하며 초원심분리기는 부식을 검사했습니다. 이 절차는 스윙 버킷 로터를 사용합니다.
첫째, 세포 물질은 세포세포를 균질화하여 제조되며, 이는 비파괴적으로 세포기관을 방출한다. 균동형은 저밀도 성분을 제거하기 위해 예비 저속 원심분리를 통해 분획될 수 있다. 다음으로, 자당 솔루션이 준비됩니다.
자크로즈는 양을 늘려 서 각 솔루션이 이전 보다 더 집중되고 따라서 밀도가 높아지므로 더 조밀합니다. 솔루션의 정확한 밀도는 유기체마다 다른 분리되는 구성 요소에 따라 달라집니다. 솔루션은 분리할 구성 요소 들 간의 밀도가 있어야 하며, 마지막 솔루션은 분석물의 밀도가 높은 구성 요소보다 밀도가 높습니다. 핵산과 같은 자당보다 조밀한 성분을 분리하기 위한 기술은 응용 분야에서 설명된다.
자당 그라데이션은 이제 깨끗한 원심분리기 튜브로 만들어집니다. 파이펫은 가장 농축된 자당 용액을 그리는 데 사용됩니다. 튜브가 똑바로 세워져 서 파이펫 팁은 벽에 높게 배치되고 액체가 꾸준히 아래로 분배됩니다. 작업 영역은 진동 및 기타 장애에서 벗어나는 것이 중요합니다.
팁을 교체한 후 밀도를 줄이는 순서대로 나머지 솔루션이 추가됩니다. 그들은 뚜렷한 층을 형성하고 혼합을 피하기 위해 신중하게 분배됩니다. 마지막으로, 세포 샘플의 약 반 밀리리터가 그라데이션 위에 첨가되고 튜브의 무게가 커집니다. 이것은 프로세스의 다음 단계인 중량 분포의 균형을 맞추는 데 사용됩니다.
원심 분리는 가능한 한 빨리 시작되어야 합니다. 튜브는 로터에 배치되며, 반대 슬롯에 동일한 무게의 빈 솔루션을 배치하여 균형을 잡습니다. 로터는 초원심분리기및 시스템 밀봉에 배치됩니다. 온도와 회전 속도와 시간이 설정됩니다. 일반적인 값은 16h에 대해 100,000 x g 이상의 힘으로 4 °C입니다.
원심 분리 후 튜브는 로터에서 철수하여 똑바로 세워지고 방해받지 않도록 주의합니다. 다른 셀룰러 구성 요소는 솔루션 계층 사이의 개별 대역으로 분획되었습니다. 분수는 주사기로 수집할 수 있습니다. 또는 튜브의 바닥은 미세한 살균 된 바늘과 멸균 튜브에서 수집 된 유출로 구멍을 뚫을 수 있습니다. 셀룰러 구성 요소가 이제 격리되었습니다. 그들은 -80 °C에서 저장할 수 있습니다.
이제 기본 절차를 살펴보셨으니 일부 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.
일반적인 응용 프로그램은 식물 세포에서 다중 단백질 복합체의 분리입니다. 이 예에서, 순환 전자 흐름을 담당하는 복합체는 광합성에서 광반응의 현장인 틸라코이드로부터 분리되고 있다. 이 절차는 14~45%의 자당 솔루션을 사용합니다. 원심분리는 4°C에서 14시간 동안 100,000xg 이상 발생합니다.
핵산은 자당보다 밀도가 높기 때문에 이소피닉 원심분리는 비파괴적으로 세포기관과 분리할 수 없습니다.
"속도-구역 원심분리"라고 하는 다른 기술이 사용됩니다. 그것은 그들의 퇴적속도에 따라 세포기관을 분리, 이는 그들의 밀도에 의존, 뿐만 아니라 그들의 적합성에 의존. 연속 그라데이션은 이 속성을 기반으로 구성 요소를 분리하는 데 사용됩니다.
절차 단계는 이소피닉 케이스를 위한 것과 유사합니다. 이 예에서 RNA-리보솜 복합체는 5%에서 20%의 연속 그라데이션을 사용하여 격리되고, 원심분리는 230,000 x g로 분리된다. 원심분리는 강수량을 방지하기 위해 몇 시간 후에 중단됩니다.
핵산 가닥은 밀도에 기초하여 서로 분리될 수 있다.
구아닌과 사이토신이 풍부한 가닥은 아데닌과 티아민이 풍부한 가닥보다 밀도가 높기 때문입니다. 이 경우, 자당이 핵산보다 밀도가 낮기 때문에 그라데이션은 자당으로 만들 수 없습니다. 대신, 염화물 그라데이션세슘은 일반적으로 1.65에서 1.75 g/mL까지 충분한 밀도와 낮은 점도를 가지고 있기 때문에 사용됩니다.
여기서 우리는 플랑크톤 DNA가 연속적인 염화염화물 그라데이션을 사용하여 정제되는 것을 봅습니다. 원심분리는 진공 상태에서 18h의 경우 1,000,000 x g 이상으로 발생합니다.
자당 밀도 그라데이션으로 초원심 분리에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 이제 밀도 그라데이션의 작동 방식, 단계 그라데이션 을 구성하는 방법, 초원심분리기를 로드하고 작동하는 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
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이해 상충이 선언되지 않았습니다.
