Ultracentrifugazione a gradiente di densità

L'ultracentrifugazione del gradiente di densità è un approccio comune per isolare e purificare le strutture cellulari per esperimenti biochimici. La tecnica utilizza una centrifuga ad alta velocità, o ultra, per separare in modo non distruttivo i componenti cellulari in un gradiente di densità. Questo video descrive i principi dell'ultracentrifugazione del gradiente di densità, fornisce una procedura generale che utilizza un gradiente di saccarosio e discute alcune applicazioni.

Iniziamo esaminando i principi delle ultracentrifughe e dei gradienti di densità. Una sospensione contiene particelle in un solvente liquido. A causa della gravità, le particelle più dense del sedimento del solvente fuoriescono mentre quelle meno dense del solvente galleggiano. Maggiore è la differenza di densità tra la particella e il solvente, più veloce è la separazione.

Un'ultracentrifuga contiene un'unità chiamata rotore, che ruota a velocità altamente controllate, simulando un forte campo gravitazionale. All'interno di questo campo, le differenze di densità tra le particelle e il solvente sono ingigantite.

La forza del campo dipende dalla velocità di rotazione. Anche un piccolo rotore a una velocità di rotazione relativamente bassa può creare una forza migliaia di volte più forte del campo gravitazionale terrestre.

Se un tubo contiene più liquidi di densità diverse, la centrifugazione li manterrà in strati separati in ordine di densità, con il liquido più denso più vicino alla base. Tale stratificazione di più liquidi è chiamata "gradiente di densità". Ci sono due tipi. Nei gradienti di passo, i liquidi di densità decrescente sono accuratamente stratificati l'uno sull'altro. In gradienti continui, i liquidi vengono miscelati in proporzioni variabili, quindi la densità diminuisce dolcemente dalla base verso l'alto.

Gli organelli cellulari possono essere separati usando un gradiente a gradini, attraverso la "centrifugazione isopycnic density-gradient". Questa è la procedura di centrifugazione più semplice e più comune.

Questa procedura viene utilizzata per separare le strutture cellulari. Più denso è l'organello, più scende, con mitocondri in alto e acidi nucleici verso il basso.

Ora che conosci i principi alla base della tecnica, vediamolo in laboratorio.

Prima di iniziare la procedura, è necessario annotare le classificazioni di velocità e densità del produttore e controllare la corrosione dell'ultracentrifuga. Questa procedura utilizza un rotore a benna oscillante.

In primo luogo, il materiale cellulare viene preparato omogeneizzando le cellule, che rilasciano in modo non distruttivo i loro organelli. L'omogeneo può essere frazionato attraverso centrifugazione preliminare a bassa velocità, per rimuovere componenti a bassa densità. Successivamente, vengono preparate le soluzioni di saccarosio.

Il saccarosio viene aggiunto in quantità crescenti in modo che ogni soluzione sia più concentrata, e quindi più densa, rispetto alla precedente. Le densità esatte delle soluzioni dipenderanno dai componenti da separare, che variano tra gli organismi. Le soluzioni devono avere densità tra quelle dei componenti da separare, con l'ultima soluzione più densa della componente più densa dell'analita. Le tecniche per separare i componenti più densi del saccarosio, come gli acidi nucleici, sono descritte nelle applicazioni.

Il gradiente di saccarosio è ora creato in un tubo di centrifuga pulito. Una pipetta viene utilizzata per redigere la soluzione di saccarosio più concentrata. Con il tubo tenuto in posizione verticale, la punta della pipetta è posizionata in alto contro la parete e il liquido erogato costantemente verso il basso. È importante che l'area di lavoro sia mantenuta libera da vibrazioni e altri disturbi.

Dopo aver sostituito la punta, le soluzioni rimanenti vengono aggiunte in ordine di densità decrescente. Sono dispensati con cura per formare strati distinti ed evitare la miscelazione. Infine, circa mezzo millilitro del campione cellulare viene aggiunto in cima al gradiente e il tubo viene pesato. Questo viene utilizzato per bilanciare la distribuzione del peso, la fase successiva del processo.

La centrifugazione dovrebbe iniziare il prima possibile. Il tubo viene posizionato nel rotore, che viene quindi bilanciato posizionando soluzioni vuote di uguale peso in fessure opposte. Il rotore è posizionato nell'ultracentrifuga e il sistema sigillato. La temperatura, la velocità di rotazione e il tempo sono impostati. I valori tipici sono 4 °C con una forza di oltre 100.000 x g per 16 ore.

Dopo la centrifugazione, il tubo viene prelevato dal rotore, avendo cura di mantenerlo in posizione verticale e indisturbato. I diversi componenti cellulari si sono frazionati in bande discrete tra gli strati della soluzione. Le frazioni possono essere raccolte con una siringa. In alternativa, il fondo del tubo può essere perforato con un ago sottile sterilizzato e il deflusso raccolto in tubi sterili. I componenti cellulari sono stati ora isolati. Possono essere conservati a -80 °C.

Ora che abbiamo visto la procedura di base, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni.

Un'applicazione tipica è l'isolamento di complessi multi-proteici nelle cellule vegetali. In questo esempio, i complessi responsabili del flusso ciclico di elettroni vengono isolati dal thylakoid, il sito della reazione luminosa nella fotosintesi. Questa procedura utilizza soluzioni discrete dal 14 al 45% di saccarosio. La centrifugazione avviene oltre 100.000 x g per 14 ore a 4 °C.

Poiché gli acidi nucleici sono più densi del saccarosio, la centrifugazione isopicnica non può separarli dagli organelli in modo non distruttivo.

Viene utilizzata una tecnica diversa, nota come "centrifugazione rate-zonale". Separa gli organelli in base ai loro tassi di sedimentazione, che dipendono non solo dalle loro densità, ma anche dalle loro conformazioni. Una sfumatura continua viene utilizzata per separare i componenti in base a questa proprietà.

Le fasi procedurali sono simili a quelle per i casi isopici. In questo esempio, i complessi RNA-ribosomi sono isolati utilizzando un gradiente continuo dal 5% al 20%, centrifugato a 230.000 x g. La centrifugazione viene interrotta dopo poche ore per evitare la co-precipitazione.

I filamenti di acido nucleico possono essere separati l'uno dall'altro sulla base della densità.

Questo perché i fili ricchi di guanina e citosina sono più densi di quelli ricchi di adenina e tiamina. In questo caso, il gradiente non può essere fatto di saccarosio, perché il saccarosio è meno denso degli acidi nucleici. Invece, vengono utilizzati gradienti di cloruro di cesio, in genere da 1,65 a 1,75 g / mL, in quanto hanno una densità sufficiente e una bassa viscosità.

Qui vediamo il DNA del plancton purificato usando un gradiente continuo di cloruro di cesio. La centrifugazione avviene a oltre 1.000.000 x g per 18 ore sotto vuoto.

Hai appena visto il video di JoVE sull'ultracentrifugazione con un gradiente di densità di saccarosio. Ora dovresti capire come funziona un gradiente di densità, come costruire un gradiente di passo e come caricare e utilizzare un ultracentrifuga. Grazie per l'attenzione!