Overview
אלקטרופורזה ג'ל דו מימדי (2DGE) היא טכניקה שיכולה לפתור אלפי ביומולקולים מתערובת. טכניקה זו כוללת שתי שיטות הפרדה נפרדות ששולבו יחד: מיקוד איזואלקטרי (IEF) ונתרן דודסיל סולפט אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד (SDS-PAGE). זה מפריד פיזית תרכובות על פני שני צירים של ג'ל על ידי הנקודות האיזואלקטריות שלהם (מאפיין אלקטרוכימי) ואת המשקלים המולקולריים שלהם.
ההליך בסרטון זה מכסה את המושגים העיקריים של 2DGE והליך כללי לאפיון הרכב של פתרון חלבון מורכב. שלוש דוגמאות לטכניקה זו מוצגות בסעיף היישומים, כולל זיהוי סמנים ביולוגיים ליזום והתקדמות המחלה, ניטור הטיפול בחולים וחקר חלבונים לאחר שינוי פוסט-טרינסלציה (PTM).
אלקטרופורזה דו-ממדית, או דו-ממדית, היא טכניקה המשתמשת בשתי שיטות הפרדה נפרדות שיכולות להפריד אלפי חלבונים מתערובת אחת. אחת הטכניקות, SDS-PAGE או נתרן דודסיל סולפט אלקטרופורזה ג'ל פולאקרילמיד, לא יכולה להפריד באופן מלא תערובות מורכבות לבד. אלקטרופורזה ג'ל דו-פעמי משווה את ה-SDS-PAGE לשיטה שנייה, מיקוד איזואלקטרי או IEF, המפרידה על בסיס נקודות איזואלקטריות, ומאפשרת רזולוציה של כל החלבונים הפוטנציאליים בתא ליסאט. וידאו זה יציג את העקרונות של אלקטרופורזה ג'ל 2D, הליך כללי, וכמה היישומים הביו-רפואיים שלה.
אלקטרופורזה ג'ל 2D מתחיל עם IEF כממד הראשון. לכל חלבון יש ערך pH, הנקרא נקודה איזואלקטרית או pI, שבו המטען נטו הוא אפס. כאשר חלבון נתון לשדה חשמלי, הוא יעבור לכיוון האלקטרודה עם מטען הפוך. דגימות של עניין נטענות על שיפוע pH משותק, או IPG, רצועות אשר מוטבעים ampholytes, מולקולות המכילות קבוצות חומציות ובסיסיות. לאחר מכן מוחל שדה חשמלי על רצועת ההדרגה pH, מה שגורם לחלבונים לנדוד עד שהם מגיעים לערך ה- pH התואם את ה- pI שלהם, שם הם מאבדים את המטען נטו שלהם.
לפני הפעלת המימד השני, החלבונים המוטמעים מטופלים ב-SDS, מנודים אותם ומספקים מטען שלילי אחיד. לאחר השלמת, רצועות IPG ממוקמות על ג'ל פוליאקרילמיד. שדה חשמלי מיושם מושך את החלבונים לכיוון האנודה, כאשר חלבונים גדולים יותר נעים לאט יותר דרך הג'ל.
לאחר שתערובת החלבון הופרדו על פי pI ומשקל מולקולרי, מפת הפרוטאום מדמיינת באמצעות כתמים, וחלבונים בעלי עניין מזוהים.
עכשיו כשדיברנו על העקרונות של אלקטרופורזה של ג'ל 2D, בואו נעבור על הליך מעבדה טיפוסי.
לפני שניתן יהיה לבצע את הניסוי, החלבונים חייבים להיות solubilized לתוך מדיה. Solubilization של המדגם מושגת על ידי דה צבירה חלבונים עם שילוב של סוכנים כאוטרופיים לשיבוש אינטראקציות מימן מליטה, דטרגנטים לא יוניים כדי למנוע שינוי של המטען של החלבונים, הפחתת סוכנים לשבור קשרים דיסולפיד, ומאגרים. כדי להסיר הפרעה חלבונים שופעים ומולקולות אחרות, החומר מופק ברצף על ידי צנטריפוגה, ואיסוף של הכדור המתקבל; ואחריו טיפול עם אנדונוקלאז, אנזים המשמש לצרוך כל DNA שיפריע לניסוי.
לאחר החלבונים כבר solubilized, רצועות IPG מוכנים על ידי שטיפה עם פתרון ניקוי רצועה נשאר הפוך לייבוש. לאחר מכן מוקצה לכל רצועה מספר מחזיק רצועה. לאחר מוכן, תמצית הסלולר נטען על הרצועות בתנועה איטית, הזזה מן השלילי לקצה החיובי. לצורך התייבשות, נייר סופג לח ממוקם על גבי האלקטרודה ומתחת לרצועות הג'ל; רצועות IPG מרופדים לאחר מכן על כלי IEF. זרם חשמלי גבוה מוחל, והחלבונים מתחילים לנדוד.
לאחר השלמת הממד הראשון, הג'ל עבור SDS-PAGE מוכן במנגנון ליהוק. רצועות IPG מטופלות על ידי הצבתן עם הפנים כלפי מטה במאגר שיווי משקל המכיל SDS. יחידת האלקטרופורזה מוכנה עם תוספת של מאגר אלקטרופורזה. רצועות IPG המטופלות נאספות באמצעות פינצטה, מונחות על גבי לוחות הג'ל, ואטומות בתמיסת איטום אגרוז. מקור מתח מחיל שדה חשמלי, המוחזק עד שהחלבונים הנעים במהירות הגבוהה ביותר הם 1 ס"מ מתחתית הג'ל.
לאחר השלמת האלקטרופורזה, החלבונים חייבים להיות חזותיים. באופן מסורתי זה מבוצע על ידי כתמים עם כחול קומאסי או כסף חנקתי. חלבונים מעניינים עשויים להיות מועברים מן הג'ל, וניתח על ידי ניתוח כתם מערבי.
גישת זיהוי שנייה כוללת כריתת החלבונים מהג'ל, עיכולם, מאשר ניתוחם באמצעות ספקטרומטריית מסה.
עכשיו שבדקנו הליך, בואו נסתכל על חלק מהשימושים לאלקטרופורזה של ג'ל 2D.
אחד השימושים הנפוצים ביותר בטכניקה זו הוא זיהוי של מולקולות המעורבות בייזום המחלה והתקדמותה. אלקטרופורזה ג'ל דו-מושבי, יחד עם ספקטרומטריית מסה, יכולים לזהות את הרגולציה של חלבונים ספציפיים באזורים חולים בהשוואה לחלבונים בריאים.
בנוסף, אלקטרופורזה ג'ל 2D שימושי בעקבות ההתקדמות של התגובה של חולים לתרופה טיפולית פוטנציאלית. ניתן לקחת דגימות מחולים בנקודות זמן שונות לאחר מתן הטיפול. בדרך זו, אלקטרופורזה ג'ל 2D בשילוב עם כתם מערבי או ניתוח ספקטרומטריית מסה, יכול לזהות חלבונים הקשורים לתגובות שליליות כגון דלקת; או היעדר חלבונים במצב מקל.
שימוש נוסף באלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי הוא בחקר מבנה החלבון ותפקודו לאחר שינוי פוסט-טרנסלציה, או PTM, שהם תוספות לחלבונים בעקבות התרגום שלהם מ- mRNA. PTM של יכול לווסת מגוון רחב של פונקציות, כולל איתות חלבון, ביטוי גנים, או לגרום נזק חמצוני. אלקטרופורזה ג'ל 2D רגיש לשינויים כגון מתילציה או אצטילציה, אשר יכול לגרום לשינוי pI, כמו גם את המשקל המולקולרי.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על אלקטרופורזה של ג'ל 2.די. וידאו זה תיאר את עקרונות הטכניקה, הליך ניסיוני טיפוסי, וכמה מיישומיה בתחום הביו-רפואה.
תודה שצפיתם!
Procedure
אלקטרופורזה ג'ל דו מימדי (2DGE) היא טכניקה שיכולה לפתור אלפי ביומולקולים מתערובת. טכניקה זו כוללת שתי שיטות הפרדה נפרדות ששולבו יחד: מיקוד איזואלקטרי (IEF) ונתרן דודסיל סולפט אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד (SDS-PAGE). זה מפריד פיזית תרכובות על פני שני צירים של ג'ל על ידי הנקודות האיזואלקטריות שלהם (מאפיין אלקטרוכימי) ואת המשקלים המולקולריים שלהם.
ההליך בסרטון זה מכסה את המושגים העיקריים של 2DGE והליך כללי לאפיון הרכב של פתרון חלבון מורכב. שלוש דוגמאות לטכניקה זו מוצגות בסעיף היישומים, כולל זיהוי סמנים ביולוגיים ליזום והתקדמות המחלה, ניטור הטיפול בחולים וחקר חלבונים לאחר שינוי פוסט-טרינסלציה (PTM).
אלקטרופורזה דו-ממדית, או דו-ממדית, היא טכניקה המשתמשת בשתי שיטות הפרדה נפרדות שיכולות להפריד אלפי חלבונים מתערובת אחת. אחת הטכניקות, SDS-PAGE או נתרן דודסיל סולפט אלקטרופורזה ג'ל פולאקרילמיד, לא יכולה להפריד באופן מלא תערובות מורכבות לבד. אלקטרופורזה ג'ל דו-פעמי משווה את ה-SDS-PAGE לשיטה שנייה, מיקוד איזואלקטרי או IEF, המפרידה על בסיס נקודות איזואלקטריות, ומאפשרת רזולוציה של כל החלבונים הפוטנציאליים בתא ליסאט. וידאו זה יציג את העקרונות של אלקטרופורזה ג'ל 2D, הליך כללי, וכמה היישומים הביו-רפואיים שלה.
אלקטרופורזה ג'ל 2D מתחיל עם IEF כממד הראשון. לכל חלבון יש ערך pH, הנקרא נקודה איזואלקטרית או pI, שבו המטען נטו הוא אפס. כאשר חלבון נתון לשדה חשמלי, הוא יעבור לכיוון האלקטרודה עם מטען הפוך. דגימות של עניין נטענות על שיפוע pH משותק, או IPG, רצועות אשר מוטבעים ampholytes, מולקולות המכילות קבוצות חומציות ובסיסיות. לאחר מכן מוחל שדה חשמלי על רצועת ההדרגה pH, מה שגורם לחלבונים לנדוד עד שהם מגיעים לערך ה- pH התואם את ה- pI שלהם, שם הם מאבדים את המטען נטו שלהם.
לפני הפעלת המימד השני, החלבונים המוטמעים מטופלים ב-SDS, מנודים אותם ומספקים מטען שלילי אחיד. לאחר השלמת, רצועות IPG ממוקמות על ג'ל פוליאקרילמיד. שדה חשמלי מיושם מושך את החלבונים לכיוון האנודה, כאשר חלבונים גדולים יותר נעים לאט יותר דרך הג'ל.
לאחר שתערובת החלבון הופרדו על פי pI ומשקל מולקולרי, מפת הפרוטאום מדמיינת באמצעות כתמים, וחלבונים בעלי עניין מזוהים.
עכשיו כשדיברנו על העקרונות של אלקטרופורזה של ג'ל 2D, בואו נעבור על הליך מעבדה טיפוסי.
לפני שניתן יהיה לבצע את הניסוי, החלבונים חייבים להיות solubilized לתוך מדיה. Solubilization של המדגם מושגת על ידי דה צבירה חלבונים עם שילוב של סוכנים כאוטרופיים לשיבוש אינטראקציות מימן מליטה, דטרגנטים לא יוניים כדי למנוע שינוי של המטען של החלבונים, הפחתת סוכנים לשבור קשרים דיסולפיד, ומאגרים. כדי להסיר הפרעה חלבונים שופעים ומולקולות אחרות, החומר מופק ברצף על ידי צנטריפוגה, ואיסוף של הכדור המתקבל; ואחריו טיפול עם אנדונוקלאז, אנזים המשמש לצרוך כל DNA שיפריע לניסוי.
לאחר החלבונים כבר solubilized, רצועות IPG מוכנים על ידי שטיפה עם פתרון ניקוי רצועה נשאר הפוך לייבוש. לאחר מכן מוקצה לכל רצועה מספר מחזיק רצועה. לאחר מוכן, תמצית הסלולר נטען על הרצועות בתנועה איטית, הזזה מן השלילי לקצה החיובי. לצורך התייבשות, נייר סופג לח ממוקם על גבי האלקטרודה ומתחת לרצועות הג'ל; רצועות IPG מרופדים לאחר מכן על כלי IEF. זרם חשמלי גבוה מוחל, והחלבונים מתחילים לנדוד.
לאחר השלמת הממד הראשון, הג'ל עבור SDS-PAGE מוכן במנגנון ליהוק. רצועות IPG מטופלות על ידי הצבתן עם הפנים כלפי מטה במאגר שיווי משקל המכיל SDS. יחידת האלקטרופורזה מוכנה עם תוספת של מאגר אלקטרופורזה. רצועות IPG המטופלות נאספות באמצעות פינצטה, מונחות על גבי לוחות הג'ל, ואטומות בתמיסת איטום אגרוז. מקור מתח מחיל שדה חשמלי, המוחזק עד שהחלבונים הנעים במהירות הגבוהה ביותר הם 1 ס"מ מתחתית הג'ל.
לאחר השלמת האלקטרופורזה, החלבונים חייבים להיות חזותיים. באופן מסורתי זה מבוצע על ידי כתמים עם כחול קומאסי או כסף חנקתי. חלבונים מעניינים עשויים להיות מועברים מן הג'ל, וניתח על ידי ניתוח כתם מערבי.
גישת זיהוי שנייה כוללת כריתת החלבונים מהג'ל, עיכולם, מאשר ניתוחם באמצעות ספקטרומטריית מסה.
עכשיו שבדקנו הליך, בואו נסתכל על חלק מהשימושים לאלקטרופורזה של ג'ל 2D.
אחד השימושים הנפוצים ביותר בטכניקה זו הוא זיהוי של מולקולות המעורבות בייזום המחלה והתקדמותה. אלקטרופורזה ג'ל דו-מושבי, יחד עם ספקטרומטריית מסה, יכולים לזהות את הרגולציה של חלבונים ספציפיים באזורים חולים בהשוואה לחלבונים בריאים.
בנוסף, אלקטרופורזה ג'ל 2D שימושי בעקבות ההתקדמות של התגובה של חולים לתרופה טיפולית פוטנציאלית. ניתן לקחת דגימות מחולים בנקודות זמן שונות לאחר מתן הטיפול. בדרך זו, אלקטרופורזה ג'ל 2D בשילוב עם כתם מערבי או ניתוח ספקטרומטריית מסה, יכול לזהות חלבונים הקשורים לתגובות שליליות כגון דלקת; או היעדר חלבונים במצב מקל.
שימוש נוסף באלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי הוא בחקר מבנה החלבון ותפקודו לאחר שינוי פוסט-טרנסלציה, או PTM, שהם תוספות לחלבונים בעקבות התרגום שלהם מ- mRNA. PTM של יכול לווסת מגוון רחב של פונקציות, כולל איתות חלבון, ביטוי גנים, או לגרום נזק חמצוני. אלקטרופורזה ג'ל 2D רגיש לשינויים כגון מתילציה או אצטילציה, אשר יכול לגרום לשינוי pI, כמו גם את המשקל המולקולרי.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על אלקטרופורזה של ג'ל 2.די. וידאו זה תיאר את עקרונות הטכניקה, הליך ניסיוני טיפוסי, וכמה מיישומיה בתחום הביו-רפואה.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
