Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.

 
Click here for the English version

2차원 젤 전기포레시스

Overview

2차원 겔 전기포진(2DGE)은 혼합물로부터 수천 개의 생체 분자를 해결할 수 있는 기술이다. 이 기술은 함께 결합 된 두 가지 분리 방법을 포함한다: 등전기 초점 (IEF) 및 나트륨 도데실 황산염 폴리 아크라이아미드 젤 전기 포근 (SDS-PAGE). 이것은 물리적으로 그들의 등전 점 (전기 화학 적 속성) 및 그들의 분자 량에 의해 젤의 두 축에 걸쳐 화합물을 분리합니다.

이 비디오에서 절차는 2DGE의 주요 개념과 복잡한 단백질 용액의 조성을 특성화하기위한 일반적인 절차를 다룹니다. 이 기술의 세 가지 예는 질병 개시 및 진행을 위한 바이오마커 검출, 환자에서의 모니터링 치료, 번역 후 변형(PTM) 다음 단백질 의 연구를 포함하여 응용 분야에서 도시된다.

2차원 또는 2D, 겔 전기전수는 단일 혼합물에서 수천 개의 단백질을 분리할 수 있는 두 가지 분리 방법을 활용하는 기술이다. 기술 중 하나, SDS-PAGE 또는 나트륨 도데딜 황산 폴리 아크라이알라미드 젤 전기 포충제, 완전히 복잡한 혼합물을 분리 할 수 없습니다. 2D 젤 전기전경은 SDS-PAGE를 제2 방법, 동전 적 초점 또는 IEF와 결합하여 등산 지점에 따라 분리되어 세포 용액에 잠재적으로 모든 단백질의 분해를 허용합니다. 이 비디오는 2D 젤 전기 전도의 원리, 일반적인 절차 및 생물 의학 응용 프로그램의 일부를 보여줍니다.

2D 젤 전기포는 IEF로 시작하여 첫 번째 차원으로 시작됩니다. 모든 단백질은 순 전하가 0인 등전기 점 또는 pI라고 불리는 pH 값을 가지고 있습니다. 단백질이 전기장을 받게 되면 반대전으로 전극쪽으로 이동합니다. 관심있는 샘플은 산성 및 기본 그룹을 모두 포함하는 분자, ampholytes, 내장 된 ampholytes가있는 고정 된 pH 그라데이션 또는 IPG 스트립에 로드됩니다. 전기장은 pH 그라데이션 스트립에 적용되어 단백질이 pI와 일치하는 pH 값에 도달할 때까지 이동하여 순 전하를 잃게 됩니다.

2차원을 실행하기 전에, 임베디드 단백질은 SDS로 처리되어 이를 규명하고 균일한 음전하를 제공합니다. 완료되면 IPG 스트립은 폴리아크릴아미드 젤에 놓입니다. 적용된 전기장은 단백질을 양극쪽으로 끌어들이고, 더 큰 단백질은 젤을 통해 더 느리게 움직입니다.

단백질 혼합물이 pI 및 분자량에 따라 분리되면, 프로테오메 맵은 얼룩을 사용하여 시각화되고, 관심 있는 단백질이 확인된다.

이제 우리는 2D 젤 전기 포의 원리를 논의했습니다, 전형적인 실험실 절차를 통해 가자.

실험을 수행하기 전에 단백질은 미디어로 용해되어야합니다. 시료의 수용성 은 수소 결합 상호 작용을 방해하기위한 chaotropic 에이전트의 조합과 단백질을 분해하여 달성, 단백질의 전하의 변경을 방지하기 위해 nonionic 세제, 이황화물 결합을 깰 에이전트를 감소, 버퍼. 풍부한 단백질 및 기타 분자를 방해하는 것을 제거하기 위해, 물질은 원심분리에 의해 순차적으로 추출되고, 생성된 펠릿의 수집; 그 다음에 는 실험을 방해하는 DNA를 섭취하는 데 사용되는 효소인 엔도누리스로 치료합니다.

단백질이 용해되면 IPG 스트립은 스트립 세척 용액으로 헹구고 거꾸로 건조시켜 제조됩니다. 각 스트립에는 스트립 홀더 번호가 할당됩니다. 일단 준비되면 셀룰러 추출물이 음수에서 양수 끝으로 천천히 슬라이딩 모션으로 스트립에 로드됩니다. 재수화를 목적으로, 축축한 블로팅 용지는 전극 의 상부와 젤 스트립 아래에 놓입니다. 그런 다음 IPG 스트립이 IEF 기기에 줄지어 있습니다. 높은 전류가 적용되고 단백질이 이동하기 시작합니다.

첫 번째 차원의 완성 후, SDS-PAGE용 젤은 주조 장치에서 제조된다. IPG 스트립은 SDS 함유 평형 버퍼에 얼굴을 아래로 배치하여 처리됩니다. 전기 전광 장치는 전기 포세이스 버퍼의 첨가와 함께 준비된다. 처리된 IPG 스트립은 핀셋을 사용하여 수집되고, 젤 플레이트 위에 놓고, 아가로즈 밀봉 용액으로 밀봉된다. 그런 다음 전압 소스는 가장 빠르게 움직이는 단백질이 젤 바닥에서 1cm가 될 때까지 유지되는 전기장을 적용합니다.

전기 전도가 완료 된 후, 단백질은 시각화해야합니다. 전통적으로 이것은 쿠마시 블루 또는 실버 질산염으로 염색하여 수행됩니다. 관심 있는 단백질은 겔으로부터 전이될 수 있고, 서양 얼룩 분석에 의해 분석될 수 있다.

두 번째 식별 접근법은 질량 분석법에 의해 분석하는 것보다 젤에서 단백질을 절제하고 소화합니다.

이제 절차를 검토했습니다, 2D 젤 전기 전광증에 대한 사용의 일부를 살펴 보자.

이 기술에 대 한 가장 일반적인 사용 중 하나는 질병 개시 및 진행에 관련 된 분자의 식별. 질량 분석과 결합된 2D 젤 전기전경은 건강한 단백질과 비교하여 병든 부위의 특정 단백질의 위 또는 하향 조절을 검출할 수 있습니다.

또한, 2D 겔 전기포고는 잠재적인 치료 약물에 대한 환자의 반응의 진행에 유용하다. 시편은 치료의 투여 후 다양한 시점에서 환자로부터 취할 수 있다. 이러한 방식으로, 2D 젤 전기포고증은 서양 얼룩 또는 질량 분광분석과 결합되어 염증과 같은 부정적인 반응과 관련된 단백질을 검출할 수 있다. 또는 완화 된 상태에서 단백질의 부재.

2D 젤 전기 포에 이션에 대한 또 다른 사용은 mRNA에서 번역 한 후 단백질에 추가되는 번역 후 변형, 또는 PTM에 따라 단백질 구조 및 기능의 연구에 있습니다. PTM은 단백질 신호, 유전자 발현, 또는 산화 손상을 일으키는 원인이 되는 각종 기능을 조절할 수 있습니다. 2D 젤 전기 포근은 메틸화 또는 아세틸화와 같은 수정에 민감하며, 이는 분자량뿐만 아니라 pI의 변화를 일으킬 수 있습니다.

방금 2D 젤 전기 전광에 대한 JoVE의 비디오를 시청했습니다. 이 비디오는 기술의 원리, 전형적인 실험 절차 및 생물 의학 분야에서의 응용 분야의 몇 가지 응용 분야를 설명했습니다.

시청해 주셔서 감사합니다!

Procedure

2차원 겔 전기포진(2DGE)은 혼합물로부터 수천 개의 생체 분자를 해결할 수 있는 기술이다. 이 기술은 함께 결합 된 두 가지 분리 방법을 포함한다: 등전기 초점 (IEF) 및 나트륨 도데실 황산염 폴리 아크라이아미드 젤 전기 포근 (SDS-PAGE). 이것은 물리적으로 그들의 등전 점 (전기 화학 적 속성) 및 그들의 분자 량에 의해 젤의 두 축에 걸쳐 화합물을 분리합니다.

이 비디오에서 절차는 2DGE의 주요 개념과 복잡한 단백질 용액의 조성을 특성화하기위한 일반적인 절차를 다룹니다. 이 기술의 세 가지 예는 질병 개시 및 진행을 위한 바이오마커 검출, 환자에서의 모니터링 치료, 번역 후 변형(PTM) 다음 단백질 의 연구를 포함하여 응용 분야에서 도시된다.

2차원 또는 2D, 겔 전기전수는 단일 혼합물에서 수천 개의 단백질을 분리할 수 있는 두 가지 분리 방법을 활용하는 기술이다. 기술 중 하나, SDS-PAGE 또는 나트륨 도데딜 황산 폴리 아크라이알라미드 젤 전기 포충제, 완전히 복잡한 혼합물을 분리 할 수 없습니다. 2D 젤 전기전경은 SDS-PAGE를 제2 방법, 동전 적 초점 또는 IEF와 결합하여 등산 지점에 따라 분리되어 세포 용액에 잠재적으로 모든 단백질의 분해를 허용합니다. 이 비디오는 2D 젤 전기 전도의 원리, 일반적인 절차 및 생물 의학 응용 프로그램의 일부를 보여줍니다.

2D 젤 전기포는 IEF로 시작하여 첫 번째 차원으로 시작됩니다. 모든 단백질은 순 전하가 0인 등전기 점 또는 pI라고 불리는 pH 값을 가지고 있습니다. 단백질이 전기장을 받게 되면 반대전으로 전극쪽으로 이동합니다. 관심있는 샘플은 산성 및 기본 그룹을 모두 포함하는 분자, ampholytes, 내장 된 ampholytes가있는 고정 된 pH 그라데이션 또는 IPG 스트립에 로드됩니다. 전기장은 pH 그라데이션 스트립에 적용되어 단백질이 pI와 일치하는 pH 값에 도달할 때까지 이동하여 순 전하를 잃게 됩니다.

2차원을 실행하기 전에, 임베디드 단백질은 SDS로 처리되어 이를 규명하고 균일한 음전하를 제공합니다. 완료되면 IPG 스트립은 폴리아크릴아미드 젤에 놓입니다. 적용된 전기장은 단백질을 양극쪽으로 끌어들이고, 더 큰 단백질은 젤을 통해 더 느리게 움직입니다.

단백질 혼합물이 pI 및 분자량에 따라 분리되면, 프로테오메 맵은 얼룩을 사용하여 시각화되고, 관심 있는 단백질이 확인된다.

이제 우리는 2D 젤 전기 포의 원리를 논의했습니다, 전형적인 실험실 절차를 통해 가자.

실험을 수행하기 전에 단백질은 미디어로 용해되어야합니다. 시료의 수용성 은 수소 결합 상호 작용을 방해하기위한 chaotropic 에이전트의 조합과 단백질을 분해하여 달성, 단백질의 전하의 변경을 방지하기 위해 nonionic 세제, 이황화물 결합을 깰 에이전트를 감소, 버퍼. 풍부한 단백질 및 기타 분자를 방해하는 것을 제거하기 위해, 물질은 원심분리에 의해 순차적으로 추출되고, 생성된 펠릿의 수집; 그 다음에 는 실험을 방해하는 DNA를 섭취하는 데 사용되는 효소인 엔도누리스로 치료합니다.

단백질이 용해되면 IPG 스트립은 스트립 세척 용액으로 헹구고 거꾸로 건조시켜 제조됩니다. 각 스트립에는 스트립 홀더 번호가 할당됩니다. 일단 준비되면 셀룰러 추출물이 음수에서 양수 끝으로 천천히 슬라이딩 모션으로 스트립에 로드됩니다. 재수화를 목적으로, 축축한 블로팅 용지는 전극 의 상부와 젤 스트립 아래에 놓입니다. 그런 다음 IPG 스트립이 IEF 기기에 줄지어 있습니다. 높은 전류가 적용되고 단백질이 이동하기 시작합니다.

첫 번째 차원의 완성 후, SDS-PAGE용 젤은 주조 장치에서 제조된다. IPG 스트립은 SDS 함유 평형 버퍼에 얼굴을 아래로 배치하여 처리됩니다. 전기 전광 장치는 전기 포세이스 버퍼의 첨가와 함께 준비된다. 처리된 IPG 스트립은 핀셋을 사용하여 수집되고, 젤 플레이트 위에 놓고, 아가로즈 밀봉 용액으로 밀봉된다. 그런 다음 전압 소스는 가장 빠르게 움직이는 단백질이 젤 바닥에서 1cm가 될 때까지 유지되는 전기장을 적용합니다.

전기 전도가 완료 된 후, 단백질은 시각화해야합니다. 전통적으로 이것은 쿠마시 블루 또는 실버 질산염으로 염색하여 수행됩니다. 관심 있는 단백질은 겔으로부터 전이될 수 있고, 서양 얼룩 분석에 의해 분석될 수 있다.

두 번째 식별 접근법은 질량 분석법에 의해 분석하는 것보다 젤에서 단백질을 절제하고 소화합니다.

이제 절차를 검토했습니다, 2D 젤 전기 전광증에 대한 사용의 일부를 살펴 보자.

이 기술에 대 한 가장 일반적인 사용 중 하나는 질병 개시 및 진행에 관련 된 분자의 식별. 질량 분석과 결합된 2D 젤 전기전경은 건강한 단백질과 비교하여 병든 부위의 특정 단백질의 위 또는 하향 조절을 검출할 수 있습니다.

또한, 2D 겔 전기포고는 잠재적인 치료 약물에 대한 환자의 반응의 진행에 유용하다. 시편은 치료의 투여 후 다양한 시점에서 환자로부터 취할 수 있다. 이러한 방식으로, 2D 젤 전기포고증은 서양 얼룩 또는 질량 분광분석과 결합되어 염증과 같은 부정적인 반응과 관련된 단백질을 검출할 수 있다. 또는 완화 된 상태에서 단백질의 부재.

2D 젤 전기 포에 이션에 대한 또 다른 사용은 mRNA에서 번역 한 후 단백질에 추가되는 번역 후 변형, 또는 PTM에 따라 단백질 구조 및 기능의 연구에 있습니다. PTM은 단백질 신호, 유전자 발현, 또는 산화 손상을 일으키는 원인이 되는 각종 기능을 조절할 수 있습니다. 2D 젤 전기 포근은 메틸화 또는 아세틸화와 같은 수정에 민감하며, 이는 분자량뿐만 아니라 pI의 변화를 일으킬 수 있습니다.

방금 2D 젤 전기 전광에 대한 JoVE의 비디오를 시청했습니다. 이 비디오는 기술의 원리, 전형적인 실험 절차 및 생물 의학 분야에서의 응용 분야의 몇 가지 응용 분야를 설명했습니다.

시청해 주셔서 감사합니다!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Tags

빈 값 문제

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter